Qui trình tiến hành phản ứng thể hiện trên Hình 2.3.
Hình 2.3. Thử nghiệm hoạt tính ức chế α-glucosidase bởi Glucose Kit
α-D-glucose và β-D-glucose trong dung dịch đƣợc duy trì cân bằng với một tỷ lệ cố định, glucose oxidase (GOD) chỉ phản ứng với β-D-glucose, mà không phản ứng với α-D-glucose. α-D-glucose phải đƣợc chuyển thành β-D-glucose nhờ mutarotase. LabAssayTMGlucose là kit phản ứng định lƣợng glucose dựa trên
Đun sôi trong 10 phút, giữ đá trong 10 phút Ống nghiệm (5ml)
Ủ ở 370C trong 10 phút
50μl dịch mẫu (đƣợc pha loãng từ 2-5 lần bằng đệm phosphate pH 6,9)
50μL enzym (20U/ml) Dung dịch enzym gốc
gồm maltase và sucrase pha trong đệm maleate
0,1M, pH 6,9 Trộn đều, ủ ở 370C trong 30 phút 50μL cơ chất (1% maltose trong đệm maleate) maltose 1% (50mg/5 ml đệm) 500μL PVPP (100mg/mL) 850μL Glucose kit Ủ trong 5’ ở nhiệt độ phòng 2ml nƣớc cất Đọc ở 505 nm
Đối chứng (-): Đệm + Đệm + Cơ chất + Kit Đối chứng (+): Đệm + Enzym + Cơ chất + Kit Mẫu trắng: Mẫu + Đệm + Cơ chất + Kit Mẫu (+): Mẫu + Enzym + Cơ chất + Kit
Cách tính % ức chế α-Glucosidase A= Đối chứng (+) - Đối chứng (-) B= Mẫu (+) - Mẫu trắng
49
phƣơng pháp enzym với sự kết hợp của mutarotase và glucose oxidase. Khi mẫu (gồm cao chiết thực vật hoặc các chất tinh sạch) đƣợc trộn với enzym, cơ chất và chất phản ứng tạo màu, dạng α-D-glucose đƣợc chuyển thành β-D-glucose bởi mutarotase. β-D-glucose bị oxi hóa nhờ GOD, qua đó có tạo H2O2. Với sự có mặt của peroxidase (POD), H2O2 đƣợc định lƣợng nhờ tạo thành sắc tố màu đỏ do phản ứng oxi hóa kết hợp với 4-Aminoantipyrine và phenol [77].
Dƣới đây là sơ đồ phản ứng : α-D-glucose β-D-glucose
β-D-glucose + O2 + H2O H2O2 + Gluconic acid 2H2O2 + 4-Aminoantipyrine + phenol Sắc tố đỏ + 4H2O