Tất cả các chuột thuộc 04 nhóm đƣợc lấy máu cho vào các ống nghiệm có sẵn chất chống đông EDTA, đem mẫu đi ly tâm lạnh với tốc độ 1500 vòng/phút trong 5 phút, hút lấy huyết tƣơng để làm xét nghiệm định lƣợng insulin bằng phản ứng ELISA.
a. Xây dựng đƣờng chuẩn insulin
Đo quang phổ của insulin chuẩn ở các nồng độ tƣơng ứng 6,4; 3,2; 1,6; 0,8; 0,4; 0,2; 0,1 ng/ml. Bảng 3.3 là kết quả đo mật độ quang của insulin tại bƣớc sóng 450nm, từ đó xây dựng phƣơng trình hồi quy tuyến tính thể hiện trên Hình 3.4.
Bảng 3.3. Mật độ quang của insulin chuẩn Nồng độ insulin
chuẩn (ng/ml) 6,4 3,2 1,6 0,8 0,4 0,2 0,1 OD (λ=450nm) 0,3025 0,185 0,0935 0,03 0,014 0,009 0,007
64
Dựa vào những kết quả thu đƣợc chúng tôi đã xây dựng phƣơng trình hồi qui tuyến tính giữa mật độ quang và nồng độ insulin chuẩn: y = 0,049x + 0,0027 (R2=0,996)
Hình 3.4. Xây dựng phƣơng trình hồi qui tuyến tính
Với phƣơng trình này chúng tôi thấy rằng với độ dốc 0,049 và điểm giao cắt trục tung 0,0027, hệ số tƣơng quan R2 bằng 1, đƣờng thẳng hồi qui tuyến tính nằm giữa và tƣơng đối sát với các điểm là giá trị OD tƣơng ứng với nồng độ insulin chuẩn () , phƣơng trình này là chính xác để chúng tôi ƣớc đoán đƣợc nồng độ insulin của chuột nhắt gây ĐTĐ type 2 dựa trên những giá trị OD đo đƣợc () sau khi thực hiện phản ứng ELISA. Trong thực tế hiếm khi có sự liên hệ 100% này mà thƣờng có sự sai lệch giữa trị số quan sát yi và trị số yi’ ƣớc đoán nằm trên đƣờng hồi qui.
b. Kết quả định lƣợng insulin trong máu chuột nhắt HFD+STZ
Thực hiện phản ứng ELISA với bộ kit chuẩn Ultra Sensitive Mouse Insulin ELISA, đo khả năng hấp thụ của cơ chất tại bƣớc sóng A450nm trong 30 phút, dựa vào đồ thị và phƣơng trình hồi qui tuyến tính đã xây dựng ở trên, chúng tôi đã định lƣợng nồng độ insulin trong máu 20 con chuột HFD + STZ đƣợc thể hiện qua Hình 3.5. Các con chuô ̣t với nồng đô ̣ đƣờng huyết cao (trên 18 mmol/l) và nồng độ insulin nằm trong khoảng 0,5 - 2 ng/ml đƣợc coi là chuột ĐTĐ type 2. Nếu xét theo tiêu chuẩn trên, thì chúng tôi đã gây đƣợc 17/20 con chuô ̣t ĐTĐ type 2, tƣ́c hiê ̣u quả đa ̣t 85%. Theo Sawant và tập thể, mô hình gây chuột nhắt ĐTĐ type 2 đã đạt hiệu quả 90%, chúng tôi đã ứng dụng thành công mô hình này.
Phương trình hồi qui giữa mật độ quang và nồng độ insulin chuẩn y = 0.049x + 0.0027 R2 = 1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0 2 4 6 8 10 nồng độ insulin chuẩn (ng/ml) OD R2= 0.996
65
Hình 3.5. Định lƣợng nồng độ insulin máu chuột HFD + STZ
3.2.1.4. Nghiệm pháp dung nạp glucose
Bên cạnh việc định lƣợng insulin, khả năng dung nạp glucose là một nghiệm pháp dùng để chẩn đoán bệnh ĐTĐ, chúng tôi đã tiến hành đánh giá khả năng dung nạp glucose của các nhóm chuột vào thời điểm ngày thứ 14 sau khi tiêm STZ, thu đƣợc kết quả trên Bảng 3.4.
Bảng 3.4. Khả năng dung nạp glucose của các nhóm chuột Đƣờng huyết Nhóm chuột 0 giờ (mmol/l) 1 giờ (mmol/l) 2 giờ (mmol/l)
HFD + STZ 23,20±1,86 30,04±1,23I*, II** 29,95±1,44I*,II**
HFD + đệm 8,81±0,34 11,20±1,20 9,25±1,1
ND + STZ 8,84±0,40 12,82±0,87 9,8±0,82
ND + đệm 6,09±0,46 6,33±1,30 6,04±1,12
(Chú thích: n=5, I sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với chuột cùng nhóm thời điểm 0 giờ, II sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với chuột ở các nhóm đối chứng ở cùng thời điểm, *p<0,05, **p<0,001 )
Sau khi cho các nhóm chuột uống dung dịch glucose với liều 5g/kg cân nặng, đƣờng huyết tăng ở tất cả các nhóm. Khả năng dung nạp glucose của nhóm HFD+STZ giảm so với các nhóm HFD+đệm, ND+STZ, ND+đệm. Tại thời điểm 1 giờ sau khi uống dung dịch đƣờng, đƣờng huyết của tất cả các chuột thuộc 3 nhóm đều tăng lên, tăng nhiều nhất là nhóm ĐTĐ type 2 (30%), sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với thời điểm 0 giờ (p<0,05), so với các nhóm đối chứng cùng thời
1.42 0.62 0.78 0.57 1.80 0.20 0.60 0.52 1.00 0.57 0.60 0.15 1.22 1.40 1.38 1.10 0.20 1.00 0.58 1.00 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 con chuột nồ ng độ i ns ul in (ng /m l)
66
điểm (p<0,001). Tại thời điểm 2 giờ, ba nhóm chuột đối chứng có đƣờng huyết giảm dần về gần mức bình thƣờng, tuy nhiên nhóm chuột ĐTĐ type 2 đƣờng huyết vẫn tăng (pI*, pII**). So với nghiên cứu của Sawant và tập thể thấy rằng đƣờng huyết nhóm chuột ĐTĐ type 2 trong thí nghiệm chúng tôi tại thời điểm 2 giờ là 29,95±1,44 mmol/l tƣơng đƣơng 571,5±25,92 mg/dl cao hơn nồng độ 25±4,3 mmol/l tƣơng đƣơng 450±78 mg/dl.