Xác định hoạt tính keratinase bằng azokeratin là một phương pháp phổ biến và có độ tin cậy cao khi nó có thể xác định chính xác đơn vị hoạt tính keratinase. Sau khi tiến hành phản ứng, dung dịch phản ứng được đo quang phổ ở bước sóng 440nm (Thí nghiệm được lặp lại 3 lần). Kết quả cho thấy dịch thủy phân đối với 2 chủng L.NĐ. 3.4 và Đ.NĐ.1.2 lần lượt là 12,1U và
12,7U (bảng 3.10).
Từ kết quả trên cho thấy 2 chủng L.NĐ.3.4 và Đ.NĐ.1.2 đều có hoạt tính keratinase. Trong đó, chủng L.NĐ.3.4 có hoạt tính là 183,33 cao hơn chủng Đ.NĐ.1.2 là 177,87 được thể hiện ở bảng 3.10. Kết quả có sự chênh lệch hoạt tính giữa 2 chủng có thể do chủng L.NĐ.3.4 phân lập trên lông vũ, còn chủng Đ.NĐ.1.2 thì phân lập trên đất. Do vậy, chủng L.NĐ.3.4 đặc hiệu với azokeratin hơn so với chủng Đ.NĐ.1.2.
Hiện nay trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về hoạt tính keratinase, trong đó có nhóm tác giả Xiang Lin và cộng sự, 1992 [23] xác định được hoạt tính keratinase là 86 U/mg thì kết quả này thấp hơn so với kết quả của chúng tôi. Nhưng so với nhóm tác giả Bin Zhang và cộng sự , 2009
Chuyên ngành Di truyền học 64 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
[66] xác định được hoạt tính keratinase là 980.9 U/mg thì kết quả này lại cao hơn. Vậy khả năng sinh keratinase phụ thuộc vào các chủng vi khuẩn khác nhau. Hai chủng L.NĐ.3.4 và Đ.NĐ.1.2 đã được phân lập có hoạt tính keratinase khá cao. Với kết quả này có thể tiến hành các nghiên cứu tiếp theo và đưa vào ứng dụng trong thực tiễn.
Bảng 3.10. Kết quả xác định hoạt tính keratinase
Tên chủng Thể tích dịch nuôi (ml) Hàm lƣợng protein(mg) Hoạt tính keretinase (U) Hoạt tính keretinase (U/mg) L.NĐ.3.4 200 44 8066,5 183,33 Đ.NĐ.1.2 200 47.6 8466,6 177,87
Chuyên ngành Di truyền học 65 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận
Phân lập và tuyển chọn được 20 chủng vi khuẩn, trong đó chọn lọc được 4 chủng vi khuẩn có khả năng sinh keratinase cao.( Đ.GT.2.2; L.SC.1.2; L.GT.2.1 và Đ.SC.1.1)
- Điều kiện nhiệt độ cho các chủng vi khuẩn này phát triển ở nhiệt độ từ 350- 400C và môi trường nuôi cấy thích hợp cho các chủng vi khuẩn trên là môi trường dinh dưỡng bình thường - MT2, có khả năng thủy phân lông vũ đạt từ 75,45% đến 81,55%, sau 4 ngày nuôi cấy lắc
- Hai chủng Đ.GT.2.2 và L.SC.1.2 được phân loại dựa vào đặc điểm hình thái, kết hợp với các phản ứng sinh hóa (kit chuẩn API 50CHB và 20NE) và phân tích trình tự gene mã hóa 16S rARN. Chủng Đ.GT.2.2 có độ tương đồng 98% so với nhiều loài thuộc chi Bacillus và chủng L.SC.1.2 có độ tương đồng 95% so với chi Pseudomonas.
- Dịch chiết protein thô keratinase của chủng L.NĐ.3.4 có hoạt tính là 183.33 U/mg và Đ.NĐ.1.2 có hoạt tính là 177.87 U/mg, khi sử dụng cơ chất
azokeratin.
- Ngoài ra, chúng tôi đã nhân được đoạn gene keratinase (Ker) và thiết kế được vector tái tổ hợp pET32a mang gene Ker để biểu hiện trong Escherichia
coli.
4.2 Kiến nghị
- Nghiên cứu quá trình tinh sạch keratinase ở dạng thô và tinh để ứng dụng trong chăn nuôi.
Chuyên ngành Di truyền học 66 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt
1. Nguyễn Đình Kim. 2001. Giáo trình vi sinh vật đất.
2. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty. 2002. Vi sinh vật
học. Nhà xuất bản giáo dục.
3. Nguyễn Lân Dũng. 1984. Vi sinh vật đất và sự chuyển hoá các hợp chất
cacbon, nitơ. Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật.
4. Nguyễn Văn Sức. 2000. Vai trò của vi sinh vật đất trong hệ thống nông
nghiệp bền vững. Tài nguyên vi sinh vật đất và sự phát triển bền vững của hệ sinh thái đất. Nhà xuất bản nông nghiệp. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
5. GS. Lê Văn Liễn. 2001. Kỹ thuật chế biến, bảo quản sản phẩm phụ giết mổ
và hải sản làm thức ăn chăn nuôi. Viện chăn nuôi.
6. Ngô Xuân Mạnh, Nguyễn Thị Lâm Đoàn, Võ Nhân Hậu, Ngô Xuân Dũng.
2008. Chọn lựa điều kiện nuôi cấy tối ưu vi khuẩn Bacillus licheniformis;
5:460-466. Khoa Công nghệ Thực Phẩm, Trường Đại Học Nông Nghiệp Hà Nội
7. Nguyễn Thu Hiền, Nguyễn Thị Quỳnh Mai, Nguyễn Huy Hoàng. 2010. Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn Chryseobacterium có khả năng thủy
phân lông vũ; 8(3A):923-928. Tạp chí Công nghệ sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
8. Nguyễn Huy Hoàng, Nguyễn Thu Hiền, Nguyễn Thị Quỳnh Mai. 2010. Phân loại và đánh giá khả năng thủy phân lông vũ của các chủng vi khuẩn
Bacillus.sp. Phân lập từ đất ở nơi giết mổ gia cầm; 8(4):1869-1875. Tạp chí Công nghệ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện KH & CN Việt Nam.
Chuyên ngành Di truyền học 67 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
9. Andersson M., Laukkanen M., Nurmiaho-Lassila E.L., Rainey F.A.,
Niemela S. L., Niemelü S. L., Sankinoja-Sanolen M.S. 1995. Bacillus thermosphaericus, sp. Nov, a new thermosphilic ureolytic Bacillus isolated from air. Syst Appl microbio; 18: 203-220 .
10. De Boer S. A., Priest F G., Diedrichsen B. 1994. On the industrial use of
Bacillus licheniformis: a review. Appl Microbiol Biotechnol; 40:595-598.
11. Galvez A., Valdivia E., Gonzalez-Segura A., Lebbadi M., Martinez-Bueno
M., Maqueda M. 1993. Purification, characterization and lytic activity against Naegleria fowleri of two amoebocins produced by Bacillus
licheniformis A12. Appl Environ Microbiol; 59:1480–1486.
12. Palleroni N. J. 1984., Genus Bacillus. In Krieg., N.R., & Holt, J.G (eds):
Bergey ,s Manual of Systematic Bacteriology. The Williams and Wilkin Co., Baltimore.
13. Zerdani I., Faid M., Malki A. 2004. Feather wastes digestion by new
isolated satrain Bacillus sp in Morocco. Afr Biotechnol; 3:67-70.
14. Molyneux G.S. 1959. The digestion of wool by a keratinolytic Bacillus.
Aus. J.Biol. Sci; 12:274-281.
15. Schmidt W.F. 1998. Innovative feather utilization strategies. National
Poultry Waste Management Symposium, Springdale, Arkansas. Auburn, AL: Auburn University Printing Services; 276-282.
16. Schmidt W.F., Line M.J. 1996. Physical and chemical structures of
poultry feather fiber fractions in fiber process development. In: Proceedings of the TAPPI Nonwovens Conference, 11–13 March 1996, Charlotte, North Carolina. Atlanta, GA: Technical Association of the Pulp and Paper Industry; 135-140.
17. Shih J.C.H. 1993. Recent developments in poultry waste digestion and
Chuyên ngành Di truyền học 68 Lớp Sinh K17 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
18. Brandelli A. 2005. Production of an extracellular keratinase from
Chryseobacterium sp. growing on raw feathers. J Biotechnol; 35-37.
19. Palleroni N. J. 1984. Genus bacillus. In Krieg, N.R., & Holt, J.G (eds):
Bergey ,s Manual of Systematic Bacteriology. The Williams and Wilkin Co., Baltimore.
20. Araragi T., Andersson M .A., Mikkola R. 1979. Density of
microorganisms in soil. Appl microbiol biotechnol; 57-61.
21. Williams C.M., Richtcr C.S., Mackenzie J.R and Shih J.C.I. 1990. Isolation, identification and characterization of a feather-degrading bacterium. J Appl Environ Microbiol; 56:1509-1515.
22. Lin X., Lee C.G., Casale SE and Shih J.C. 1992. Purification and
characterization of a keratinase from a feather degrading Bacillus Licheniformis strain. J Appl Environ Ailcrobiol; 58:3271-3275.
23. Xiang Lin.,Chung-Ginn Lee., Ellen S., Jason C. H. 1992. Purification and
Characterization of a Keratinase from a Feather-Degrading Bacillus
licheniformis strain. J Appl Environ Ailcrobiol; 58(10):3271–3275.
24. Gupta R., Ramnani P. 2006. Microbial keratinases and their prospective
applications: an overview. Appl microbiol biotechnol; 70:21-33.
25. Egrow N.X. 1983. Microbiology practice. Mir Publishers, Moxcova.
26. Zhang B., Sun Z., Jiang D., Niu T G. 2009. Isolation and purification of alkaline keratinase from, African Journal of Biotechnology Vol. 8; 11:2598- 2603.
27. Tamilmani P., Umamaheswari A., Vinayagam A. B. 2008. Production of
Chuyên ngành Di truyền học 69 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Isolated from Poultry Farm Soilin Namakkal District (Tamilnadu), Prakash International Journal of Poultry Science 7; 2:184-188.
28. Lin X., Lee C.G., Casale E.S., Shih J.C.H. 1992. Purification and
characterization of a keratinase from a feather-degrading Bacillus licheniformis strain, Appl. Environ. Microbiol., 58: 3271-3275.
29. Radha S., Gunasekaran P. 2007. Cloning and expression of keratinase
gene in Bacillusmegaterium and optimization of fermentation conditions for the production of keratinase by recombinant strain, Journal application microbiol; 103:1301–1310.
30. Godde C., Sahm K., Brouns S.J.J., Kluskens L.D., van der Oost J., de Vos
W.M., Antranikian G. 2005.Cloning and expression of islandisin,a new thermostable subtilis in from Fervidobacteriumislandicum, in Escherichiacoli, Appl. Environ.Microbiol; 71:3951–3958.
31. Joo H S.; Kumar C.G.; Park G.C.; Kim K.T, Paik S.R. and Chang C.S.
October 2002. Optimization of the production of an extracellular alkaline protease from Bacillus hirikoshii. Process Biochemistry, vol. 38; 2:155-159.
32. Sambrook, Fritsch E.F., Maniatis T. 2001. ’’Moleculer Cloning: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Alaboratory manual’’. Cold spring Harbor Lab. Press, Cold spring Harbor.
33. W. Akhtar., H.G. Edwards. 1997. Fourier-transform Raman spectroscopy
of mammalian and avian keratotic biopolymers Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc; 53A:81-90.
34. L. Kreplak., J. Doucet., P. Dumas., F. Briki. 2004. New aspects of the
alpha-helix to beta-sheet transition in stretched hard alpha-keratin fibers Biophys J; 87:640-647.
35. I. Zerdani., M. Faid., A. Malki. 2004. Feather wastes digestion by new isolated strains Bacillus sp. in Morocco. Afr J Biotechnol; 3: 67-70.
Chuyên ngành Di truyền học 70 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
36. M.C. Papadopoulos. 1986. The effect of enzymatic treatment on amino
acid content and nitrogen characteristics of feather meal. Anim Feed Sci Technol; 16:151-156.
37. J.J. Noval., W.J. Nickerson. 1995. Decomposition of native keratin by
Streptomyces fradiae J Bacteriol; 77:251-263.
38. B. Bockle., R. Muller. 1997. Reduction of Disulfide Bonds by Streptomyces
pactum during Growth on Chicken Feathers Appl Environ Microbiol; 63:790- 792.
39. P. Ramnani., R. Gupta. 2004. Optimization of medium composition for
keratinase production on feather by Bacillus licheniformis RG1 using statistical methods involving response surface methodology Biotechnol Appl Biochem; 40:191-196.
40. A. Ghosh., K. Chakrabarti., D. Chattopadhyay. 2008. Degradation of raw feather by a novel high molecular weight extracellular protease from newly
isolated Bacillus cereus DCUW J Ind Microbiol Biotechnol; 35:825-834. Epub
2008 Apr 2022.
41. M. Rozs., L. Manczinger., C. Vagvolgyi., F. Kevei. 2001. Secretion of a
trypsin-like thiol protease by a new keratinolytic strain of Bacillus licheniformis
FEMS Microbiol Lett; 205:221-224.
42. X. Lin., C.G. Lee., E.S. Casale., J.C. Shih. 1992. Purification and
Characterization of a Keratinase from a Feather-Degrading Bacillus
licheniformis Strain Appl Environ Microbiol; 58:3271-3275.
43. A.G. Kumar., S. Swarnalatha., S. Gayathri., N. Nagesh., G. Sekaran. 2008. Characterization of an alkaline active-thiol forming extracellular serine
keratinase by the newly isolated Bacillus pumilus J Appl Microbiol;104:411-419.
44. H.J. Suh., H.K. Lee. 2001. Characterization of a keratinolytic serine protease
Chuyên ngành Di truyền học 71 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
45. R. Kumar., S. Balaji., T.S. Uma., A.B. Mandal., P.K. Sehgal. 2008.
Optimization of influential parameters for extracellular keratinase production by
Bacillus subtilis (MTCC9102) in solid state fermentation using Horn meal--a biowaste management Appl Biochem Biotechnol; 160:30-39.
46. R. Konwarh., N. Karak., S.K. Rai., A.K. Mukherjee. 2009. Polymer-assisted
iron oxide magnetic nanoparticle immobilized keratinase Nanotechnology; 20: 225-107. Epub 222009 May 225112.
47. E. Ionata., F. Canganella., G. Bianconi., Y. Benno., M. Sakamoto., A.
Capasso., M. Rossi., F. La Cara. 2008. A novel keratinase from Clostridium sporogenes bv. pennavorans bv. nov., a thermotolerant organism isolated from solfataric muds Microbiol Res1; 63:105-112. Epub 2006 Nov 2007.
48. S.L. Wang., W.T. Hsu., T.W. Liang., Y.H. Yen., C.L. Wang. 2008.
Purification and characterization of three novel keratinolytic metalloproteases
produced by Chryseobacterium indologenes TKU014 in a shrimp shell powder
medium Bioresour Technol; 99:5679-5686. Epub 2007 Nov 5626.
49. G.W. Nam., D.W. Lee., H.S. Lee., N.J. Lee., B.C. Kim., E.A. Choe., J.K. Hwang., M.T. Suhartono., Y.R. Pyun. 2002. Native-feather degradation by Fervidobacterium islandicum AW-1, a newly isolated keratinase-producing thermophilic anaerobe Arch Microbiol; 178:538-547.
50. A.B. Friedrich., G. Antranikian. 1996. Keratin Degradation by
Fervidobacterium pennavorans, a Novel Thermophilic Anaerobic Species of the Order Thermotogales Appl Environ Microbiol; 62:2875-2882.
51. C. Bernal., I. Diaz., N. Coello. 2006. Response surface methodology for the
optimization of keratinase production in culture medium containing feathers produced by Kocuria rosea Can J Microbiol; 52:445-450.
52. R.C. Thys., A. Brandelli. 2006. Purification and properties of a keratinolytic
Chuyên ngành Di truyền học 72 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
53. A. Gessesse., R. Hatti-Kaul., B.A. Gashe., B. Mattiasson. 2003. Novel
alkaline proteases from alkaliphilic bacteria grown on chicken feather Enzyme and Microbial Technology; 32:519-524.
54. S. Mitsuiki., M. Sakai., Y. Moriyama., M. Goto., K. Furukawa. 2002.
Purification and some properties of a keratinolytic enzyme from an alkaliphilic Nocardiopsis sp. TOA-1 Biosci Biotechnol Biochem; 66:164-167.
55. Z.J. Cao., Q. Zhang., D.K. Wei., L. Chen., J. Wang., X.Q. Zhang., M.H. Zhou. 2009. Characterization of a novel Stenotrophomonas isolate with high keratinase activity and purification of the enzyme J Ind Microbiol Biotechnol; 36:181-188.
56. R. Tatineni., K.K. Doddapaneni., R.C. Potumarthi., R.N. Vellanki., M.T.
Kandathil., N. Kolli., L.N. Mangamoori. 2008. Purification and characterization of an alkaline keratinase from Streptomyces sp Bioresour
Technol; 99:1596-1602.
57. F. Xie., Y. Chao., X. Yang., J. Yang., Z. Xue., Y. Luo., S. Qian. 2009.
Purification and characterization of four keratinases produced by
Streptomyces sp. strain 16 in native human foot skin medium Bioresour (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Technol; 101: 344-350.
58. P. Bressollier., F. Letourneau., M. Urdaci., B. Verneuil. 1999. Purification
and characterization of a keratinolytic serine proteinase from Streptomyces albidoflavus Appl Environ Microbiol; 65: 2570-2576.
59. B. Bockle., B. Galunsky., R. Muller. 1995. Characterization of a
keratinolytic serine proteinase from Streptomyces pactum DSM 40530 Appl
Environ Microbiol; 61:3705-3710.
60. D.G. Syed., J.C. Lee., W.J. Li., C.J. Kim., D. Agasar. 2009. Production,
characterization and application of keratinase from Streptomyces gulbargensis Bioresour Technol; 100:1868-1871.
Chuyên ngành Di truyền học 73 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
61. R.R. Chitte., S. Dey. 2001. Cloning and expression of an actinokinase
gene from a thermophilic Streptomyces in Escherechia coli Indian J Exp Biol; 39: 410-415.
62. S. Riessen., G. Antranikian. 2001. Isolation of Thermoanaerobacter
keratinophilus sp. nov., a novel thermophilic, anaerobic bacterium with keratinolytic activity Extremophiles; 5:399-408.
63. S. Balaji., M.S. Kumar., R. Karthikeyan., R. Kumar., S. Kirubanandan., R.
Sridhar., P.K. Sehgal. 2008. Purification and characterization of an extracellular keratinase from a hornmeal-degrading Bacillus subtilis MTCC
(9102). World Journal of Microbiology and Biotechnology; 24:2741-2745.
64. C.G. Cai., J.S. Chen., J.J. Qi., Y. Yin., X.D. Zheng. 2008. Purification and
characterization of keratinase from a new Bacillus subtilis strain J Zhejiang
Univ Sci B; 9:713-720.
65. L. Manczinger., M. Rozs., C.S. Vágvölgyi., F. Kevei. 2003. Isolation and
characterization of a new keratinolytic Bacillus licheniformis strain World J
Microbiol Biotechnol; 19:35-39.
66. B. Zhang., D.D. Jiang., W.W. Zhou., H.K. Hao., T.G. Niu. 2009. Isolation
and characterization of a new Bacillus sp. 50-3 with highly alkaline keratinase activity from Calotes versicolor faeces. World J Microbiol Biotechnol; 25:583-590.
67. J.M. Kim., W.J. Lim., H.J. Suh. 2001. Feather-degrading Bacillus species
from poultry waste. Process Biochem; 37:287-291.
68. P.O. Werlang., A. Brandelli. 2005. Characterization of a novel feather-
degrading Bacillus sp. strain Appl Biochem Biotechnol; 120:71-79.
69. A. Gushterova., E. Vasileva-Tonkova., E. Dimova., P. Nedkov., T. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Haertlé. 2005. Keratinase production by newly isolated Antarctic
Chuyên ngành Di truyền học 74 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
70. A.H. Mohamedin. 1999. Isolation, identification and some cultural
conditions of a protease-producing thermophilic Streptomyces strain grown on chicken feather as a substrate. Int Biodeterior Biodegrad; 43:13-21.
71. L. Szabo., A. Benedek., M.L. Szabo., G. Barabas. 2000. Feather
degradation with a thermotolerant Streptomyces graminofaciens strain. World J Microbiol Biotechnol; 16:252-255.
72. T. Matsui., Y. Yamada., H. Mitsuya., Y. Shigeri., Y. Yoshida., Y. Saito.,
H. Matsui., K. Watanabe. 2009. Sustainable and practical degradation of intact chicken feathers by cultivating a newly isolated thermophilic Meiothermus ruber H328 Appl Microbiol Biotechnol; 82:941-950.
73. H. Takami., Y. Nogi., K. Horikoshi. 1999. Reidentification of the
keratinase-producing facultatively alkaliphilic Bacillus sp. AH-101 as Bacillus halodurans Extremophiles; 3:293-296.
74. S. Balaji., M.S. Kumar., R. Karthikeyan., R. Kumar., S. Kirubanandan., R.
Sridhar., P.K. Sehgal. 2008. Purification and characterization of an extracellular keratinase from a hornmeal-degrading Bacillus subtilis MTCC
(9102). World J Microbiol Biotechnol; 24:2741-2745.
75. R. Tsuboi., I. Ko., K. Takamori., H. Ogawa. 1989. Isolation of a
keratinolytic proteinase from Trichophyton mentagrophytes with enzymatic activity at acidic pH Infect Immun; 57:3479-3483.