Lấy một vòng que cấy sinh khối tế bào đã được ria sạch sau 24 giờ cho lên lam kính đã có 1 giọt KOH 3%. Đánh tan sinh khối, trong khi làm tan sinh khối thì nhấc que cấy để kiểm tra độ kết dính. Kết quả:
+ Với các chủng mà độ kết dính nhớt thì kết luận chủng vi khuẩn đó là gram âm (G-).
+ Với chủng mà độ kết dính không nhớt thì kết luận chủng vi khuẩn đó là gram dương (G+
).
2.2.7. Phƣơng pháp phân loại vi khuẩn theo đặc tính sinh hoá
Chủng phân lập được chọn lọc và tiến hành phân loại bằng kit chuẩn sinh hoá API 50 CHB và 20 NE, quá trình phân loại được tiến hành theo chỉ dẫn của nhà cung cấp.
Phương pháp thử API 50 CHB dùng để xác định nhóm vi khuẩn thuộc
Gram dương (G+
)
Đây là phương pháp dùng 49 nguồn carbonhydrat để lên men (API 50 CHB) và nhận biết vi khuẩn Bacillus trong đó có các phản ứng với các chất
biết từ trước, thử các phản ứng và tra bảng đối chiếu với khoá phân loại để tìm ra tên loài của chủng. Chỉ dùng một khuẩn lạc sạch để thử phản ứng. 49 phép thử sinh hoá API 50 CHB được trình bày ở bảng 2.1.
Bảng 2.1: 49 phép thử lên men API 50 CHB
STT Phép thử Cơ chất STT Phép
thử
Cơ chất
0 CTL Control 25 ESC Esculine
1 GFL Glycerol 26 SAL Salicine
Chuyên ngành Di truyền học 29 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3 DARA D-Arabinose 28 MAL Maltose
4 LARA L-Arabinose 29 LAC Lactose
5 RIB Ribose 30 MEL Melibiose
6 DXYL D-Xylose 31 SAC Saccharose
7 LXYL L-Xylose 32 TRE Trehalose
8 ADO Adonitol 33 INU Inuline
9 βMXL β Methyl-xyloside 34 MLZ Melezitose
10 GAL Galactose 35 DRAF D-Rafinose
11 DGLU D-Glucose 36 AMI Amidon
12 DFRU D-Fructose 37 GLY Glycogene
13 DMAN D-Mannose 38 XLT Xylitol
14 LSBE L-Sorbose 39 BGEN Β-Gentiobiose
15 RHA Rhamnose 40 DTUR D-Turanose
16 DUL Dulcitol 41 DLYX D-Lyxose
17 INO Inositol 42 DTAG D-Tagatose
18 MAN Mannitol 43 DFUC D-Fucose
19 SOR Sorbitol 44 LFUC L-Fucose
20 αMDM α Methyl-D- mannoside 45 DARA D-Arabitol 21 α MMG α Methyl-D- glucoside 46 LARA L-Arabitol 22 NAG N-Acetyl glucosamine 47 GNT Gluconate
23 AMY Amygdaline 48 2CG 2 ceto-gluconate
24 ARB Arbutine 49 5CG 5 ceto-gluconate
Cách tiến hành:
- Làm ẩm phiến thử bằng nước cất vô trùng.
- Hoà tan 1 khuẩn lạc vào 1 ml dung dịch muối sinh lý sao cho độ đục (OD) đạt khoảng 0,3.
-Lấy 0,3 ml dịch trên cho vào 5 ml dung dịch muối sinh lý và lấy 0,6 ml cho vào môi trường 50 CHB.
- Dùng pipet để cấy huyền phù vi khuẩn từ môi trường 50 CHB/E vào 50 giếng của bộ kit 50 CHB.
Chuyên ngành Di truyền học 30 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Trong quá trình tiến hành không để các bọt khí hình thành trong các giếng thử.
- Phủ parafin lên các giếng của bộ kit 50 CHB.
- Đặt kit thử vào tủ ấm 30oC, đọc kết quả sau 24 giờ và 48 giờ. - Tra bảng đối chiếu với khoá phân loại để tìm ra tên loài của chủng.
Phương pháp thử API 20NE dùng cho các trực khuẩn gram âm (G-
), không
có nhu cầu dinh dưỡng đặc biệt
Đây là phương pháp dùng 20 phép thử hóa sinh để nhận biết vi khuẩn gram âm trong đó có các phản ứng với các chất đã biết từ trước, thử các phản ứng và tra bảng đối chiếu với khóa phân loại(bảng chỉ số Analytical Profile Index, 5th edision, BioMerieux S.A, 1992) để tìm ra tên loài của chủng. Chỉ dùng 1 khuẩn lạc sạch để phản ứng. 20 phép thử hóa sinh được trình bày ở bảng 2.2.
Bảng 2.2: 20 phép thử sinh hóa API 20 NE
STT Phép thử Cơ chất Phản ứng/Enzyme
1 NO3 KNO3
Khử nitrat thành nitrit/ khi thêm Zn thì
khử nitrat thành nito
2 TRP Tryptophan Tạo indol
3 GLU Glucose Lên men Glucose
4 ADH Arginin Tổng hợp argnin
dihidrolaza
5 URE Ure Tổng hợp ureaza
6 ESC Esculin Tổng hợp esculin
7 GEL Gelatin Thủy phân gelatin
8 PNPG p-nitrophenyl β-D-
galactosepyranosit
Tổng hợp β- galactosidaza
9 GLU Glucose Đồng hóa
10 AGA Arabinose Đồng hóa
11 MNE Mannose Đồng hóa
12 MAN Mannitol Đồng hóa
13 NAG N- axetyl- glucosamin Đồng hóa
14 MAN Malat Đồng hóa
Chuyên ngành Di truyền học 31 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
16 CAP Caprat Đồng hóa
17 ADI Adipat Đồng hóa
18 MNT Maltose Đồng hóa
19 CIT Citrat Đồng hóa
20 PAC Phenyl-axetat Đồng hóa
Cách tiến hành:
-Làm ẩm phiến thử bằng nước cất vô trùng.
-Hoà tan 1 khuẩn lạc vào 2,5 ml dung dịch muối sinh lý sao cho độ đục (OD) đạt khoảng 0,3.
-Dùng pipet để cấy huyền phù vi khuẩn vào 8 giếng đầu tiên (từ NO3 đến PNPD).
-Lấy 0,2 ml dịch tế bào trên cho vào môi trường AUX trộn đều. Dùng dịch này nhỏ đầy vào các giếng còn lại.
-Trong quá trình tiến hành không để có các bọt khí hình thành trong các giếng thử.
-Phủ parafin lên các giếng 3, 4, 5.
-Đặt kit thử vào tủ ấm 30oC, đọc kết quả sau 24 giờ và 48 giờ. -Tra bảng đối chiếu với khoá phân loại để tìm ra tên loài của chủng.
2.2.8. Chọn dòng gene keratinase vào vector biểu hiện pET32a 2.2.8.1. Tách chiết DNA tổng số của chủng vi khuẩn 2.2.8.1. Tách chiết DNA tổng số của chủng vi khuẩn
DNA tổng số được tách chiết theo phương pháp Masterson và cộng sự
[32], bao gồm các bước như sau:
-Bước 1: lấy 5 ml môi trường LB lỏng cho vào ống nghiệm, sau đó lấy tế bào VK cho vào ống nghiệm nuôi lắc qua đêm ở nhiệt độ 30 - 370C tới gần pha Log
-Bước 2: hút khoảng 2 ml dịch VK trên vào ống eppendort -Bước 3: Ly tâm 12000 v/p, 10 phút → thu cặn
-Bước 4: Hòa tan cặn trong 567 µl TE (10:1), votex -Bước 5: Bổ sung thêm 40 µl SDS 10%, mix tan cặn
Chuyên ngành Di truyền học 32 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
-Bước 6: Bổ sung thêm 3µlproteaza K, ủ ở 370
C/1giờ -Bước 7: Bổ sung thêm 280 µl NaCl 6 M, trộn đều, ủ ở 650
C/10 phút
-Bước 8: Chiết bằng Chloroform:izoamyl (24:1), votex → ly tâm 12000 v/p, 10’→thu dịch nổi
-Bước 9: Tủa DNA bằng Ethanol 100% → Ủ -200C qua đêm (ít nhất 4 giờ) -Bước 10: Ly tâm 12000 v/p, 10 phút →thu cặn
-Bước 11: Rửa cặn bằng Ethanol 70%
-Bước 12: Ly tâm 12000 v/p, 10 phút →thu cặn
-Bước 13: Sấy khô → bổ sung 50 µl nước khử ion vô trùng → lấy 4 µl đem điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%.
Điện di trên gel agarose
Để kiểm tra kết quả tách DNA, sản phẩm tách chiết được tiến hành điện di trên gel agarose. Hòa tan 0,8% agarose trong 100 ml dung dịch đệm TAE 1X, đun sôi cho gel agarose tan hoàn toàn. Để nhiệt hạ xuống khoảng 500
C - 600C, đổ dung dịch agarose vào khuôn gel điện di đã cài sẵn răng lược thích hợp. Sau 30-60 phút, khi gel đông cứng đặt gel vào bể điện di. Đổ đệm TAE 1X ngập cách mặt gel từ 1-2 mm, nhẹ nhàng gỡ bỏ răng lược ra. Mẫu DNA được trộn với 3 µl đệm mẫu (20% glyxerol; 0,1M Tris-HCL pH 8,0; 0,01 M EDTA pH 8,0; 0,25% bromphenol blue) tra mẫu vào các giếng nhỏ trên gel, chạy điện di cùng với DNA thang chuẩn (DNA thang chuẩn 1 kb) để xác định kích thước phân tử. Tiến hành điện di với dòng điện 1 chiều có hiệu điện thế 100V, cường độ dòng điện 60-80 mA, trong 30 phút.
Nhuộm DNA bằng dung dịch Ethidium Bromide (EtBr)
Bản gel được lấy nhẹ nhàng khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr nồng độ 0,5 µg/ml trong thời gian tử 10 – 15 phút có lắc nhẹ trên máy lắc rồi rửa bản gel bằng nước cất. Quan sát bản gel dưới ánh sáng tử ngoại (UV) với bước sóng 254 nm trên máy soi DNA, chụp ảnh trên máy GEL-DOC.
Chuyên ngành Di truyền học 33 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.2.8.2. Nhân bản đoạn DNA bằng PCR
Kĩ thuật PCR do Mullis và cộng sự phát minh ra năm 1985. Kĩ thuật này cho phép nhân 1 đoạn DNA mong muốn từ hệ gene của cơ thể sinh vật thành nhiều bản sao.
Nguyên tắc phản ứng PCR là sử dụng enzyme ADN polymerase chịu nhiệt để tổng hợp trong ống nghiệm các đoạn DNA mới từ mạch khuôn trong môi trường có dNTP và chứa các cặp mồi đặc hiệu.
Nhân đoạn gene mã hóa 16S rRNA
Đoạn gene mã hóa 16S rRNA được nhân lên từ ADN tổng số nhờ phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu: 16SF 5’-CGG AAT TCA TTG CTG GAC CTG- 3’; 16SR 5’-GTC CTA GAG CTT TGT CTT TAG G-3’ của gene 16S rARN từ vi khuẩn, phản ứng PCR cho sản phẩm là đoạn gene dài khoảng1,5 kb.
Phản ứng nhân bản đoạn gene 16S rARN được tiến hành với tổng thể tích 25 µl/mẫu, bao gồm các thành phần sau đây:
Thành phần phản ứng PCR Thể tích (µl) Nước 14.7 Buffer 5 dNTP(10pmol) 2 Mồi xuôi(10pmol) 1 Mồi ngược(10pmol) 1 Khuôn DNA 1 Enzyme 0.3 Tổng 25
Chuyên ngành Di truyền học 34 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chu trình nhiệt
Sau khi phản ứng kết thúc, lấy 8 µl sản phẩm PCR điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Sản phẩm PCR được tinh sạch → Đọc trình tự gene → Phân tích số liệu để định tên chủng vi khuẩn.
Nhân đoạn gene keratinase
-Đoạn gene keratinase được nhân lên từ ADN tổng số nhờ phản ứng PCR sử dụng cặp mồi:
-Primer-F: 5’-CGT GGG ATC CAA AAA ATT GTG GAT CAG C- 3’ -Primer-R: 5’- TTA TTC TCG AGC TGC TTG TAC GTT GAT - 3’ -Thành phần phản ứng PCR gồm: Thành phần phản ứng PCR Thể tích (µl) Nước 39,7 Buffer 5 dNTP(10pmol) 2 Mồi xuôi(10pmol) 1 Mồi ngược(10pmol) 1 Khuôn DNA 1 Enzyme 0,3 Tổng 50
Chu trình nhiệt giống phần 2.2.8.2. Sau khi phản ứng kết thúc, lấy 5µl sản phẩm PCR điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%.
Chuyên ngành Di truyền học 35 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Thôi gel tinh sạch gene
Phương pháp thôi gel tinh sạch được sử dụng theo phương pháp của William và đồng tác giả (1990) và GenJETTM Genomic DNA purification Kit -Bước 1: Điện di sản phẩm PCR
-Bước 2: Cắt gel cho vào ống eppendort, xác định trọng lượng miếng gel: + Cân ống eppendort mới
+ Cân ống eppendort chứa miếng gel → xác định trọng lượng miếng gel -Bước 3: Bổ sung 400 µl binding buffer ↔ 100 mg gel (0,8 %)
-Bước 4: Ủ cho tan gel hoàn toàn ở nhiệt độ 50-600
C, 10 phút
-Bước 5: Cho gel lên cột → ly tâm 12000 v/p trong 2 phút → đổ phần dịch -Bước 6: Bổ sung 500µl Wash solusion (ethanol) → ly tâm 12000 v/p trong 2 phút→ đổ phần dịch
-Bước 7: Bổ sung 30– 50 µl elution buffer sau đó ủ ở nhiệt độ 5-100
C trong nhiệt độ phòng→ ly tâm
-Bước 8: Lấy 5 µl điện di sản phẩm để kiểm tra độ tinh sạch của gene
Gắn sản phẩm PCR đã thôi gel tinh sạch vào vector pET32a
Phương pháp tách dòng gene được sử dụng theo Sambrook và cs (2001) Phản ứng cắt – nối
Mục đích của phương pháp này là đưa một đoạn DNA ngoại lai vào một vector thích hợp nhờ enzyme T4 DNA ligase. Enzyme này xúc tác cho quá trình hình thành liên kết nối hai đoạn DNA.
Cách tiến hành:
-Dùng 2 enzyme cắt Xho I; BamH I, cắt mở vòng vector và cắt đoạn gene keratinase. Thành phần phản ứng gồm:
Thành phần Thể tích( µl)
Nước 1
Chuyên ngành Di truyền học 36 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Xho I 1
BamH I 1
DNA 15
Tổng 20
-Tinh sạch đoạn gene keratinase và vector sau khi đã xử lý bằng enzyme cắt -Lai đoạn gene keratine trên vào vector pET32a. Thành phần phản ứng nối:
Thành phần Thể tích (µl) H2O 0,5 Buffer 2 Vector 5 DNA 12 Enzyme ligase 0,5 Tổng 20
-Hỗn hợp phản ứng trên được ủ qua đêm ở 160 C Biến nạp vào vi khuẩn E.coli DH10B
Chuẩn bị tế bào khả biến
-Bước 1: Cấy chủng E.coli DH10B lên môi trường LB đặc, nuôi qua đêm ở
370C
-Bước 2: Lấy 1 khuẩn lạc đơn cấy vào 3 ml môi trường LB lỏng, lắc qua đêm ở 370
C
-Bước 3: Cấy chuyển 0,8 ml dịch nuôi sang môi trường LB lỏng, nuôi lắc tiếp khoảng 3 giờ → Đo OD đạt từ 0,6 → 0,8
-Bước 4: Chuyển dịch trên sang ống ly tâm đã giữ ở trên đá, 30’ →giữ lạnh trên đá 15 phút
Chuyên ngành Di truyền học 37 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
-Bước 5: Ly tâm với tốc độ 4200 v/p, 10 phút, 40C → loại bỏ dịch ly tâm, giữ lại cặn
-Bước 6: Hòa tan cặn nhẹ nhàng trong 20-30 ml 0,1M CaCl2, giữ trên đá 40 phút
-Bước 7: Ly tâm với tốc độ 4200 v/p, 10 phút, 40C →thu cặn →hòa tan cặn nhẹ nhàng trong 0,7-1,5 ml 0,1M CaCl2
-Bước 8: Bổ sung 800 µl 0,1M CaCl2 và 400 µl glyxerol → chia đều vào các ống eppendort (50-100 µl) → giữ ở -800
C -Bước 9: Biến nạp
Quy trình biến nạp
-Lấy tế bào khả biến DH10B giữ ở -200C ra để trên đá 30 phút
-Bổ sung 5 µl DNA plasmid vào ống tế bào khả biến → mix nhẹ, để trên đá 15-20 phút
-Sốc nhiệt 420
C, trong 1 phút → để trên đá 5 phút -Bổ sung 0.5 ml môi trường LB lỏng, nuôi lắc 370
C, trong 1 giờ
-Cấy trải 50 µl trên đĩa pettri chứa LB đặc có bổ sung thêm kháng sinh ampicillin (50 µl/ml), nuôi ở 370C qua đêm → theo dõi khuẩn lạc mọc → lựa chon khuẩn lạc trắng để xác định khả năng chứa plasmid tái tổ hợp.
Tách chiết DNA plasmid tái tổ hợp
-Bước 1: Nuôi chủng biến nạp E.coli DH10B trong môi trường LB lỏng có
chứa kháng sinh (nuôi lắc 200 v/p ở 370C qua đêm)
-Bước 2: Chuyển dịch nuôi vào ống eppendort → Ly tâm 6000 v/p, 6 phút, 40C → thu tế bào
-Bước 3: Loại bỏ dịch, giữ phần tủa ở đáy ống eppendort
-Bước 4: Bổ sung 150 µl dung dịch SOL I, Votex tan tế bào
-Bước 5: Bổ sung 150 µl dung dịch SOL II, đảo đều để trên đá
-Bước 6: Bổ sung 150 µl dung dịch SOL III, đảo nhẹ để trên đá
Chuyên ngành Di truyền học 38 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
-Bước 7: Ly tâm 12000 v/p, 40
C, 15 phút →hút dịch trong sang ống eppendort
-Bước 8: Bổ sung Chloroform : Isoamylalchol (24:1)→lắc mạnh vài lần → Ly tâm 12000 v/p, 40C, 15 phút → tạo phân lớp rồi hút lấy phần dịch nổi sang ống eppendort mới
-Bước 9: Bổ sung 2 thể tích Ethanol 100% , đảo đều →tủa DNA plasmid ở - 200C trong 3 giờ →Ly tâm 12000 v/p, 40C, 15 phút, loại bỏ dịch nổi thu cặn DNA
-Bước 10: Bổ sung 1ml Ethanol 70% → Ly tâm 12000 v/p, 40
