2.2.8.1. Tách chiết DNA tổng số của chủng vi khuẩn
DNA tổng số được tách chiết theo phương pháp Masterson và cộng sự
[32], bao gồm các bước như sau:
-Bước 1: lấy 5 ml môi trường LB lỏng cho vào ống nghiệm, sau đó lấy tế bào VK cho vào ống nghiệm nuôi lắc qua đêm ở nhiệt độ 30 - 370C tới gần pha Log
-Bước 2: hút khoảng 2 ml dịch VK trên vào ống eppendort -Bước 3: Ly tâm 12000 v/p, 10 phút → thu cặn
-Bước 4: Hòa tan cặn trong 567 µl TE (10:1), votex -Bước 5: Bổ sung thêm 40 µl SDS 10%, mix tan cặn
Chuyên ngành Di truyền học 32 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
-Bước 6: Bổ sung thêm 3µlproteaza K, ủ ở 370
C/1giờ -Bước 7: Bổ sung thêm 280 µl NaCl 6 M, trộn đều, ủ ở 650
C/10 phút
-Bước 8: Chiết bằng Chloroform:izoamyl (24:1), votex → ly tâm 12000 v/p, 10’→thu dịch nổi
-Bước 9: Tủa DNA bằng Ethanol 100% → Ủ -200C qua đêm (ít nhất 4 giờ) -Bước 10: Ly tâm 12000 v/p, 10 phút →thu cặn
-Bước 11: Rửa cặn bằng Ethanol 70%
-Bước 12: Ly tâm 12000 v/p, 10 phút →thu cặn
-Bước 13: Sấy khô → bổ sung 50 µl nước khử ion vô trùng → lấy 4 µl đem điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%.
Điện di trên gel agarose
Để kiểm tra kết quả tách DNA, sản phẩm tách chiết được tiến hành điện di trên gel agarose. Hòa tan 0,8% agarose trong 100 ml dung dịch đệm TAE 1X, đun sôi cho gel agarose tan hoàn toàn. Để nhiệt hạ xuống khoảng 500
C - 600C, đổ dung dịch agarose vào khuôn gel điện di đã cài sẵn răng lược thích hợp. Sau 30-60 phút, khi gel đông cứng đặt gel vào bể điện di. Đổ đệm TAE 1X ngập cách mặt gel từ 1-2 mm, nhẹ nhàng gỡ bỏ răng lược ra. Mẫu DNA được trộn với 3 µl đệm mẫu (20% glyxerol; 0,1M Tris-HCL pH 8,0; 0,01 M EDTA pH 8,0; 0,25% bromphenol blue) tra mẫu vào các giếng nhỏ trên gel, chạy điện di cùng với DNA thang chuẩn (DNA thang chuẩn 1 kb) để xác định kích thước phân tử. Tiến hành điện di với dòng điện 1 chiều có hiệu điện thế 100V, cường độ dòng điện 60-80 mA, trong 30 phút.
Nhuộm DNA bằng dung dịch Ethidium Bromide (EtBr)
Bản gel được lấy nhẹ nhàng khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr nồng độ 0,5 µg/ml trong thời gian tử 10 – 15 phút có lắc nhẹ trên máy lắc rồi rửa bản gel bằng nước cất. Quan sát bản gel dưới ánh sáng tử ngoại (UV) với bước sóng 254 nm trên máy soi DNA, chụp ảnh trên máy GEL-DOC.
Chuyên ngành Di truyền học 33 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.2.8.2. Nhân bản đoạn DNA bằng PCR
Kĩ thuật PCR do Mullis và cộng sự phát minh ra năm 1985. Kĩ thuật này cho phép nhân 1 đoạn DNA mong muốn từ hệ gene của cơ thể sinh vật thành nhiều bản sao.
Nguyên tắc phản ứng PCR là sử dụng enzyme ADN polymerase chịu nhiệt để tổng hợp trong ống nghiệm các đoạn DNA mới từ mạch khuôn trong môi trường có dNTP và chứa các cặp mồi đặc hiệu.
Nhân đoạn gene mã hóa 16S rRNA
Đoạn gene mã hóa 16S rRNA được nhân lên từ ADN tổng số nhờ phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu: 16SF 5’-CGG AAT TCA TTG CTG GAC CTG- 3’; 16SR 5’-GTC CTA GAG CTT TGT CTT TAG G-3’ của gene 16S rARN từ vi khuẩn, phản ứng PCR cho sản phẩm là đoạn gene dài khoảng1,5 kb.
Phản ứng nhân bản đoạn gene 16S rARN được tiến hành với tổng thể tích 25 µl/mẫu, bao gồm các thành phần sau đây:
Thành phần phản ứng PCR Thể tích (µl) Nước 14.7 Buffer 5 dNTP(10pmol) 2 Mồi xuôi(10pmol) 1 Mồi ngược(10pmol) 1 Khuôn DNA 1 Enzyme 0.3 Tổng 25
Chuyên ngành Di truyền học 34 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chu trình nhiệt
Sau khi phản ứng kết thúc, lấy 8 µl sản phẩm PCR điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Sản phẩm PCR được tinh sạch → Đọc trình tự gene → Phân tích số liệu để định tên chủng vi khuẩn.
Nhân đoạn gene keratinase
-Đoạn gene keratinase được nhân lên từ ADN tổng số nhờ phản ứng PCR sử dụng cặp mồi:
-Primer-F: 5’-CGT GGG ATC CAA AAA ATT GTG GAT CAG C- 3’ -Primer-R: 5’- TTA TTC TCG AGC TGC TTG TAC GTT GAT - 3’ -Thành phần phản ứng PCR gồm: Thành phần phản ứng PCR Thể tích (µl) Nước 39,7 Buffer 5 dNTP(10pmol) 2 Mồi xuôi(10pmol) 1 Mồi ngược(10pmol) 1 Khuôn DNA 1 Enzyme 0,3 Tổng 50
Chu trình nhiệt giống phần 2.2.8.2. Sau khi phản ứng kết thúc, lấy 5µl sản phẩm PCR điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%.
Chuyên ngành Di truyền học 35 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Thôi gel tinh sạch gene
Phương pháp thôi gel tinh sạch được sử dụng theo phương pháp của William và đồng tác giả (1990) và GenJETTM Genomic DNA purification Kit -Bước 1: Điện di sản phẩm PCR
-Bước 2: Cắt gel cho vào ống eppendort, xác định trọng lượng miếng gel: + Cân ống eppendort mới
+ Cân ống eppendort chứa miếng gel → xác định trọng lượng miếng gel -Bước 3: Bổ sung 400 µl binding buffer ↔ 100 mg gel (0,8 %)
-Bước 4: Ủ cho tan gel hoàn toàn ở nhiệt độ 50-600
C, 10 phút
-Bước 5: Cho gel lên cột → ly tâm 12000 v/p trong 2 phút → đổ phần dịch -Bước 6: Bổ sung 500µl Wash solusion (ethanol) → ly tâm 12000 v/p trong 2 phút→ đổ phần dịch
-Bước 7: Bổ sung 30– 50 µl elution buffer sau đó ủ ở nhiệt độ 5-100
C trong nhiệt độ phòng→ ly tâm
-Bước 8: Lấy 5 µl điện di sản phẩm để kiểm tra độ tinh sạch của gene
Gắn sản phẩm PCR đã thôi gel tinh sạch vào vector pET32a
Phương pháp tách dòng gene được sử dụng theo Sambrook và cs (2001) Phản ứng cắt – nối
Mục đích của phương pháp này là đưa một đoạn DNA ngoại lai vào một vector thích hợp nhờ enzyme T4 DNA ligase. Enzyme này xúc tác cho quá trình hình thành liên kết nối hai đoạn DNA.
Cách tiến hành:
-Dùng 2 enzyme cắt Xho I; BamH I, cắt mở vòng vector và cắt đoạn gene keratinase. Thành phần phản ứng gồm:
Thành phần Thể tích( µl)
Nước 1
Chuyên ngành Di truyền học 36 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Xho I 1
BamH I 1
DNA 15
Tổng 20
-Tinh sạch đoạn gene keratinase và vector sau khi đã xử lý bằng enzyme cắt -Lai đoạn gene keratine trên vào vector pET32a. Thành phần phản ứng nối:
Thành phần Thể tích (µl) H2O 0,5 Buffer 2 Vector 5 DNA 12 Enzyme ligase 0,5 Tổng 20
-Hỗn hợp phản ứng trên được ủ qua đêm ở 160 C Biến nạp vào vi khuẩn E.coli DH10B
Chuẩn bị tế bào khả biến
-Bước 1: Cấy chủng E.coli DH10B lên môi trường LB đặc, nuôi qua đêm ở
370C
-Bước 2: Lấy 1 khuẩn lạc đơn cấy vào 3 ml môi trường LB lỏng, lắc qua đêm ở 370
C
-Bước 3: Cấy chuyển 0,8 ml dịch nuôi sang môi trường LB lỏng, nuôi lắc tiếp khoảng 3 giờ → Đo OD đạt từ 0,6 → 0,8
-Bước 4: Chuyển dịch trên sang ống ly tâm đã giữ ở trên đá, 30’ →giữ lạnh trên đá 15 phút
Chuyên ngành Di truyền học 37 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
-Bước 5: Ly tâm với tốc độ 4200 v/p, 10 phút, 40C → loại bỏ dịch ly tâm, giữ lại cặn
-Bước 6: Hòa tan cặn nhẹ nhàng trong 20-30 ml 0,1M CaCl2, giữ trên đá 40 phút
-Bước 7: Ly tâm với tốc độ 4200 v/p, 10 phút, 40C →thu cặn →hòa tan cặn nhẹ nhàng trong 0,7-1,5 ml 0,1M CaCl2
-Bước 8: Bổ sung 800 µl 0,1M CaCl2 và 400 µl glyxerol → chia đều vào các ống eppendort (50-100 µl) → giữ ở -800
C -Bước 9: Biến nạp
Quy trình biến nạp
-Lấy tế bào khả biến DH10B giữ ở -200C ra để trên đá 30 phút
-Bổ sung 5 µl DNA plasmid vào ống tế bào khả biến → mix nhẹ, để trên đá 15-20 phút
-Sốc nhiệt 420
C, trong 1 phút → để trên đá 5 phút -Bổ sung 0.5 ml môi trường LB lỏng, nuôi lắc 370
C, trong 1 giờ
-Cấy trải 50 µl trên đĩa pettri chứa LB đặc có bổ sung thêm kháng sinh ampicillin (50 µl/ml), nuôi ở 370C qua đêm → theo dõi khuẩn lạc mọc → lựa chon khuẩn lạc trắng để xác định khả năng chứa plasmid tái tổ hợp.
Tách chiết DNA plasmid tái tổ hợp
-Bước 1: Nuôi chủng biến nạp E.coli DH10B trong môi trường LB lỏng có
chứa kháng sinh (nuôi lắc 200 v/p ở 370C qua đêm)
-Bước 2: Chuyển dịch nuôi vào ống eppendort → Ly tâm 6000 v/p, 6 phút,
40C → thu tế bào
-Bước 3: Loại bỏ dịch, giữ phần tủa ở đáy ống eppendort -Bước 4: Bổ sung 150 µl dung dịch SOL I, Votex tan tế bào -Bước 5: Bổ sung 150 µl dung dịch SOL II, đảo đều để trên đá -Bước 6: Bổ sung 150 µl dung dịch SOL III, đảo nhẹ để trên đá
Chuyên ngành Di truyền học 38 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
-Bước 7: Ly tâm 12000 v/p, 40
C, 15 phút →hút dịch trong sang ống eppendort
-Bước 8: Bổ sung Chloroform : Isoamylalchol (24:1)→lắc mạnh vài lần → Ly tâm 12000 v/p, 40C, 15 phút → tạo phân lớp rồi hút lấy phần dịch nổi sang ống eppendort mới
-Bước 9: Bổ sung 2 thể tích Ethanol 100% , đảo đều →tủa DNA plasmid ở - 200C trong 3 giờ →Ly tâm 12000 v/p, 40C, 15 phút, loại bỏ dịch nổi thu cặn DNA
-Bước 10: Bổ sung 1ml Ethanol 70% → Ly tâm 12000 v/p, 40
C, 15 phút, loại bỏ dịch nổi thu cặn DNA
-Bước 11: Làm khô → hòa cặn DNA trong TE chứa RNAase (nồng độ 20 µl/ml), ủ ở 370
C trong 1giờ để loại RNA
-Bước 12: Điện di trên gel agarose 0,8% để kiểm tra→Tinh sạch DNA plasmid.
Cắt kiểm tra sản phẩm tách DNA plasmid sau biến nạp
Để xác định plasmid đã lựa chọn có mang đoạn DNA cần gắn hay không, ta sử dụng 2 enzyme cắt thích hợp có cả điểm cắt trên đoạn DNA chèn vào. Phản ứng được tiến hành với thành phần sau:
Thành phần Thể tích (µl) H2O 9 Buffer 5 Xho I 0,5 BamH I 0,5 plasmid DNA 10
Chuyên ngành Di truyền học 39 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Tổng 25
Sau đó hỗn hợp phản ứng được trộn đều, ủ ở 370
C trong 3 h hoặc qua đêm → Điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%.
2.2.9. Phân tích hoạt tính keratinase ngoại bào
Thử hoạt tính keratinase bằng azokeratin
- Bước 1: Nuôi lắc chủng vi khuẩn trong 3 ml môi trường có bổ sung lông vũ ở 370
C, 150 v/p, qua đêm
- Bước 2: Chuyển sang nuôi lượng lớn trong 100 ml môi trường, ở 370C, 72 giờ, 150 v/p
- Bước 3: Ly tâm 10000 v/p, 10 phút thu dịch nổi sử dụng làm enzyme thô
- Bước 4: Trộn hỗn hợp phản ứng: 200 µl enzyme thô + 1.6 ml (buffer glycine/NaOH + azokeratin)
- Bước 5: Ủ hỗn hợp phản ứng ở 600C, 15 phút. Sau đó ngừng phản ứng, bổ sung
1.8 ml TCA (trichloroaxetic axit) vào hỗn hợp phản ứng ở nồng độ cuối cùng
là 100 g/l
- Bước 6: Ly tâm 10000 v/p, 10 phút, đo quang phổ ở bước sóng 440 nm
Trong đó, cứ 0.01 giá trị hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 440 nm tương ứng với 1U hoạt tính enzyme ở 600
C / 15 phút
Định lượng Protein bằng phương pháp Bradford
Xây dựng đƣờng chuẩn bằng cách đo OD tại bƣớc sóng 595 nm của BSA chuẩn ở các nồng độ khác nhau
Chuyên ngành Di truyền học 40 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bước 1: Pha loãng Stock BSA 10 mg/ml ra 0.1 mg/ml, pha loãng 100 lần Cách làm: Hút 5 µl BSA vào ống eppendorf 1,5 ml sau đó bổ sung 495 µl nước khử ion
Bước 2: Pha dung dịch mầu (Coomasie brilliant blue Reagent 1X)
Cách làm: Pha 3 ml dung dịch Coomasie brilliant blue (đã có EtOH) với 3 ml dung dịch axit photphoric 85%
Bước 3: Chuẩn bị 5 ống eppendorf 1,5 ml với các nồng độ protein chuẩn BSA như sau: STT Nồng độ BSA (µg/µl) BSA 0,1 mg/ml (µl) H2O (µl) Brardford reagent (µl) Tổng thể tích (µl) 0 0 0 200 1000 1200 1 0.01 20 180 1000 1200 2 0.02 40 160 1000 1200 3 0.03 60 140 1000 1200 4 0.04 80 120 1000 1200 5 0.05 100 100 1000 1200
Bước 4: Trộn nhẹ đều hỗn hợp phản ứng trên, để ở nhiệt độ phòng ít nhất 15 phút (tối đa không quá 1giờ)
Bước 5: Đo giá trị OD ở bước sóng 595nm, ghi lại kết quả của các ống. Sau đó lập đường chuẩn y = ax + b với trục hoành là nồng độ BSA và trục tung là giá trị OD/595 nm ứng với mỗi ống, bằng phần mềm Excel.
Chuyên ngành Di truyền học 41 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bước 1: Bổ sung 80 µl mẫu vào 120 µl nước khử ion và 1000 µl Brardford 1X Bước 2: Trộn đều hỗn hợp phản ứng, để ở nhiệt độ phòng tối thiểu 15 phút (tối đa không quá 1 giờ).
Bước 3: Đem đo trên máy quang phổ ở bước sóng 595 nm, để đo độ hấp thụ của các dung dịch protein, rồi ghi lại kết quả hấp thụ protein sau đó tính toán nồng độ Protein dựa trên đường chuẩn BSA bằng phần mềm Excel.
Công thức tính:
a, b là hệ số đường chuẩn protein
D: Độ pha loãng (D= 2.5 lần)
PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả lấy mẫu ở các địa điểm
Mẫu đất, lông được lấy ở nơi chăn nuôi và giết mổ gia cầm tại các địa điểm khác nhau (Bảng 3.1), giữ 40
C.
Bảng 3.1 Địa điểm lấy mẫu
STT Tên viết tắt Địa điểm lấy mẫu
1 L.GT Lông gà tại khu chăn nuôi hộ gia đình ở Gang Thép 2 Đ.GT Đất, phân gà tại khu chăn nuôi hộ gia đình ở Gang Thép 3 L.SC Lông gà tại khu chăn nuôi hộ gia đình ở Sông Công 4 Đ.SC Đất, phân gà tại khu chăn nuôi hộ gia đình ở Sông Công
L.GT: Lông Gang Thép Đ.GT: Đất Gang Thép L.SC: Lông Sông Công Đ.SC: Đất Sông Công
Chuyên ngành Di truyền học 42 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.2. Giá trị pH của các mẫu đất
Giá trị pH là một chỉ tiêu để đánh giá tính chất hóa lý của đất. Dựa vào phương pháp xác định giá trị pH của đất (Bảng 3.2) ta có được kết quả như sau:
Bảng 3.2: Giá trị pH của các mẫu đất
Mẫu pH (H2O ) pH (KCl )
Đ.GT 6,5 5,5
Đ.SC 6,5 5,5
Đ.GT: Đất Gang Thép Đ.SC: Đất Sông Công
Ở bảng 4 cho thấy giá trị pH của các mẫu đất không thấy chênh lệch nhiều, hầu hết là trung tính hoặc axit yếu. pH này là rất thích hợp cho nhiều loại vi khuẩn phát triển. Các vi khuẩn thuỷ phân lông vũ gia cầm thường phát triển trên môi trường có pH từ 7,0 - 7,2.
3.3. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả thủy phân keratin keratin
Từ 4 mẫu đất và lông thu thập tại các khu chăn nuôi và nơi giết mổ gia cầm ở Thái Nguyên, đã phân lập được 20 chủng vi khuẩn. Trong đó có 6
