Thử hoạt tính keratinase bằng azokeratin
- Bước 1: Nuôi lắc chủng vi khuẩn trong 3 ml môi trường có bổ sung lông vũ ở 370
C, 150 v/p, qua đêm
- Bước 2: Chuyển sang nuôi lượng lớn trong 100 ml môi trường, ở 370C, 72 giờ, 150 v/p
- Bước 3: Ly tâm 10000 v/p, 10 phút thu dịch nổi sử dụng làm enzyme thô
- Bước 4: Trộn hỗn hợp phản ứng: 200 µl enzyme thô + 1.6 ml (buffer glycine/NaOH + azokeratin)
- Bước 5: Ủ hỗn hợp phản ứng ở 600C, 15 phút. Sau đó ngừng phản ứng, bổ sung
1.8 ml TCA (trichloroaxetic axit) vào hỗn hợp phản ứng ở nồng độ cuối cùng là 100 g/l
- Bước 6: Ly tâm 10000 v/p, 10 phút, đo quang phổ ở bước sóng 440 nm
Trong đó, cứ 0.01 giá trị hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 440 nm tương ứng với 1U hoạt tính enzyme ở 600
C / 15 phút
Định lượng Protein bằng phương pháp Bradford
Xây dựng đƣờng chuẩn bằng cách đo OD tại bƣớc sóng 595 nm của BSA chuẩn ở các nồng độ khác nhau
Chuyên ngành Di truyền học 40 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bước 1: Pha loãng Stock BSA 10 mg/ml ra 0.1 mg/ml, pha loãng 100 lần Cách làm: Hút 5 µl BSA vào ống eppendorf 1,5 ml sau đó bổ sung 495 µl nước khử ion
Bước 2: Pha dung dịch mầu (Coomasie brilliant blue Reagent 1X)
Cách làm: Pha 3 ml dung dịch Coomasie brilliant blue (đã có EtOH) với 3 ml dung dịch axit photphoric 85%
Bước 3: Chuẩn bị 5 ống eppendorf 1,5 ml với các nồng độ protein chuẩn BSA như sau: STT Nồng độ BSA (µg/µl) BSA 0,1 mg/ml (µl) H2O (µl) Brardford reagent (µl) Tổng thể tích (µl) 0 0 0 200 1000 1200 1 0.01 20 180 1000 1200 2 0.02 40 160 1000 1200 3 0.03 60 140 1000 1200 4 0.04 80 120 1000 1200 5 0.05 100 100 1000 1200
Bước 4: Trộn nhẹ đều hỗn hợp phản ứng trên, để ở nhiệt độ phòng ít nhất 15 phút (tối đa không quá 1giờ)
Bước 5: Đo giá trị OD ở bước sóng 595nm, ghi lại kết quả của các ống. Sau đó lập đường chuẩn y = ax + b với trục hoành là nồng độ BSA và trục tung là giá trị OD/595 nm ứng với mỗi ống, bằng phần mềm Excel.
Chuyên ngành Di truyền học 41 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bước 1: Bổ sung 80 µl mẫu vào 120 µl nước khử ion và 1000 µl Brardford 1X Bước 2: Trộn đều hỗn hợp phản ứng, để ở nhiệt độ phòng tối thiểu 15 phút (tối đa không quá 1 giờ).
Bước 3: Đem đo trên máy quang phổ ở bước sóng 595 nm, để đo độ hấp thụ của các dung dịch protein, rồi ghi lại kết quả hấp thụ protein sau đó tính toán nồng độ Protein dựa trên đường chuẩn BSA bằng phần mềm Excel.
Công thức tính:
a, b là hệ số đường chuẩn protein
D: Độ pha loãng (D= 2.5 lần)
PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả lấy mẫu ở các địa điểm
Mẫu đất, lông được lấy ở nơi chăn nuôi và giết mổ gia cầm tại các địa điểm khác nhau (Bảng 3.1), giữ 40
C.
Bảng 3.1 Địa điểm lấy mẫu
STT Tên viết tắt Địa điểm lấy mẫu
1 L.GT Lông gà tại khu chăn nuôi hộ gia đình ở Gang Thép 2 Đ.GT Đất, phân gà tại khu chăn nuôi hộ gia đình ở Gang Thép 3 L.SC Lông gà tại khu chăn nuôi hộ gia đình ở Sông Công 4 Đ.SC Đất, phân gà tại khu chăn nuôi hộ gia đình ở Sông Công
L.GT: Lông Gang Thép Đ.GT: Đất Gang Thép L.SC: Lông Sông Công Đ.SC: Đất Sông Công
Chuyên ngành Di truyền học 42 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.2. Giá trị pH của các mẫu đất
Giá trị pH là một chỉ tiêu để đánh giá tính chất hóa lý của đất. Dựa vào phương pháp xác định giá trị pH của đất (Bảng 3.2) ta có được kết quả như sau:
Bảng 3.2: Giá trị pH của các mẫu đất
Mẫu pH (H2O ) pH (KCl )
Đ.GT 6,5 5,5
Đ.SC 6,5 5,5
Đ.GT: Đất Gang Thép Đ.SC: Đất Sông Công
Ở bảng 4 cho thấy giá trị pH của các mẫu đất không thấy chênh lệch nhiều, hầu hết là trung tính hoặc axit yếu. pH này là rất thích hợp cho nhiều loại vi khuẩn phát triển. Các vi khuẩn thuỷ phân lông vũ gia cầm thường phát triển trên môi trường có pH từ 7,0 - 7,2.
3.3. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả thủy phân keratin keratin
Từ 4 mẫu đất và lông thu thập tại các khu chăn nuôi và nơi giết mổ gia cầm ở Thái Nguyên, đã phân lập được 20 chủng vi khuẩn. Trong đó có 6 chủng có hoạt tính thủy phân lông vũ cao đạt tỷ lệ khoảng từ 71,65% - 81,55%, 3 chủng không có hoạt tính, còn lại 11 chủng có tỷ lệ thủy phân khoảng từ ≥ 50 % (Bảng 3.3).
Qua nghiên cứu thử nghiệm nuôi lắc, có thể thấy rằng việc được nuôi lắc giúp vi khuẩn sinh trưởng, phát triển nhanh và mạnh hơn. Nhìn vào khả năng thuỷ phân lông vũ của vi khuẩn qua từng ngày theo dõi ta có các kết luận:
Qua quá trình thu mẫu, đã phân lập và chọn lọc được các chủng vi khuẩn có khả năng sinh keratinase cao trên môi trường nuôi cấy. Lượng lông vũ còn lại cho thấy mức độ thủy phân của các chủng là rất khác nhau theo từng ngày nuôi cấy, và khả năng thủy phân của các chủng vi khuẩn đạt cao nhất vào
Chuyên ngành Di truyền học 43 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
ngày thứ 4. Trong đó, có 4 chủng phân hủy keratin mạnh nhất là Đ.GT.2.2; L.SC.1.2; L.GT.2.1 và Đ.SC.1.1 với tỷ lệ là 75,45% → 81,55% (bảng 3.3). Sự đánh giá khả năng thủy phân lông vũ, được xác định bằng công thức đã nêu ở phần phương pháp. So sánh với các phương pháp đánh giá khả năng thủy phân lông vũ trên thế giới thì hầu hết sử dụng cơ chất Azokeratin, tuy mang lại hiệu quả chính xác nhưng tốn công, giá thành rất cao [39,42,52], phương pháp mà chúng tôi áp dụng là phương pháp sinh học. Đây là phương pháp mới, dễ làm, đơn giản, không tốn kém. Song song với sự đánh giá khả năng thủy phân lông vũ, thì pH của các chủng vi khuẩn tăng dần sau từng ngày nuôi cấy, đặc biệt là các chủng vi khuẩn sinh trưởng và phát triển mạnh. Ngày đầu tiên là pH = 7,0 - 7,5; rồi tăng dần lên đến pH = 8 - 8,5 và thường dừng lại ở pH = 9,2 - 9,5.
Những chủng vi khuẩn sinh trưởng phát triển tốt, thì sau ngày đầu tiên sử dụng chất dinh dưỡng có trong môi trường, ngày thứ hai sẽ tiến hành thủy phân lông vũ. Khi những sợi lông vũ đã tan hết vào môi trường thì những chủng vi khuẩn này sẽ bắt đầu thuỷ phân cuống lông. Theo dõi từng ngày, chúng tôi nhận thấy sự biến đổi về khả năng thủy phân của vi khuẩn xảy ra rất rõ ràng.
Những chủng vi khuẩn sinh trưởng và phát triển yếu thì việc thuỷ phân lông vũ không xảy ra hoặc xảy ra rất chậm, pH của các chủng này không tăng mà luôn dừng lại ở pH = 7,0 - 7,3.
Bảng 3.3: Tỉ lệ thuỷ phân lông vũ của các chủng tuyển chọn
STT Tên chủng Trọng lƣợng lông vũ ban đầu (g) Trọng lƣợng lông vũ còn lại (g) Tỉ lệ thuỷ phân (%) 1 ĐC 0,2 0,2 0 2 Đ.GT.1.1 0,2 0,0837 ± 0,0 1 58,15 3 Đ.GT.1.2 0,2 0,0567 ± 0,014 71,65 4 Đ.GT.1.3 0,2 0,2 0 5 Đ.GT.1.4 0,2 0,0663 ± 0,011 66,85
Chuyên ngành Di truyền học 44 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
6 Đ.GT.1.5 0,2 0,0721 ± 0,02 63,95 7 L.SC.1.2 0,2 0,0415 ± 0,012 79,25 8 Đ.GT.2.1 0,2 0,0952 ± 0,016 52,40 9 Đ.GT.2.2 0,2 0,0391 ± 0,021 80,45 10 Đ.GT.2.3 0,2 0,2 0 11 Đ.GT.2.4 0,2 0,0650 ±0,015 67.50 12 L.GT.2.1 0,2 0,0479±0,031 75,45 13 L.GT.1.2 0,2 0,0767±0,031 61,65 14 L.SC.1.1 0,2 0,0371±0,031 81,55 15 Đ.SC.1.2 0,2 0,0872±0,035 56,40 16 Đ.SC.1.3 0,2 0,0371±0,031 63,45 17 L.SC.1.4 0,2 0,0926±0,037 53,70 18 Đ.SC.1.5 0,2 0,0896±0,046 55,20 19 Đ.SC.1.1 0,2 0,0554±0,021 72,30 20 L.SC.1.4 0,2 0,0679±0,031 66,05 21 L.SC.2.1 0,2 0,0856±0,045 57,20
Từ kết quả này chúng tôi chọn ra 4 chủng L.SC.1.2; Đ.SC.1.1; L.GT.2.1; Đ.GT.2.2 để lựa chọn môi trường thích hợp (Hình 3.1).
Hình 3.1: Khả năng thủy phân lông vũ của 4 chủng vi khuẩn chọn lọc ( Sau 4 ngày nuôi cấy lắc)
3.4. Lựa chọn môi trƣờng thích hợp của các chủng đƣợc chọn lọc
Mỗi vi khuẩn có tác động rất riêng và đặc trưng lên từng cơ chất trong những điều kiện nhất định. Vì vậy việc lựa chọn môi trường thích hợp cho từng chủng vi khuẩn là rất cần thiết. Có nhiều chủng vi khuẩn sinh trưởng tốt trên môi trường giàu dinh dưỡng đồng thời tạo ra hoạt tính enzyme tối đa. Ngược lại, có những chủng vi khuẩn sinh trưởng tốt trên môi trường nghèo dinh dưỡng nhưng vẫn có thể tạo ra các hoạt tính enzyme tối đa. Cả 4 chủng
Chuyên ngành Di truyền học 45 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
sau khi chọn lọc được tiến hành nuôi thử nghiệm và đánh giá khả năng thủy phân lông vũ trên 3 môi trường khác nhau (môi trường giàu dinh dưỡng-MT1; môi trường dinh dưỡng bình thường -MT2; môi trường nghèo dinh dưỡng- MT3). Kết quả cho thấy sự khác biệt rõ rệt về sự sinh trưởng, mật độ tế bào, pH cũng như khả năng thủy phân lông vũ của các chủng vi khuẩn trên các môi trường khác nhau (Hình 8-9). Nhìn chung pH dịch nuôi của các chủng đều tăng nhanh trong 2 ngày đầu nuôi cấy với khoảng pH từ 7,0 - 8,5, bắt đầu chững và dừng lại vào ngày thứ 4 ở pH trong khoảng từ 9,0 – 9,5.
Dựa vào khả năng thuỷ phân của các chủng có tỉ lệ cao sau thời gian nuôi lắc thử nghiệm, thấy rằng ở môi trường giàu dinh dưỡng (MT1) cả 4 chủng chọn lọc đều sinh trưởng tốt, mật độ tế bào cao khoảng ≥ 7 x 10 6
CFU/ml. Tuy nhiên khả năng thủy phân lông vũ lại không cao, chỉ đạt 59 – 69% sau 4 ngày nuôi cấy lắc, mặt khác ở môi trường nghèo dinh dưỡng khả năng thủy phân lông vũ thể hiện không rõ ràng. Sự sinh trưởng của các chủng tăng chậm, số lượng tăng rất ít trên môi trường nghèo dinh dưỡng – môi trường nước. Vì trên môi trường này không có chất đinh dưỡng cần thiết nên các chủng này không thể phát triển và tăng về số lượng được.
Sự thuỷ phân của các chủng diễn ra mạnh nhất trên môi trường dinh dưỡng bình thường (MT2), hay môi trường lông vũ. Tại môi trường này chất dinh dưỡng chủ yếu dùng để vi khuẩn phát triển là muối. Sau 2 ngày nuôi lắc mật độ chủng vi khuẩn trên môi trường này tăng tối đa. Và các chủng vi khuẩn này bắt đầu có sự thuỷ phân lông vũ. Sau 4 ngày nuôi cấy thì trên môi trường này trọng lượng lông còn lại là rất ít. Số lượng còn lại chỉ từ 0,0479 g đến 0,0371 g. Như vậy, theo công thức tỉ lệ phần trăm thủy phân (2.2.2.1), sau 4 ngày nuôi lắc thì các chủng này đã thuỷ phân được từ 75,28% - 81,11%. Vậy khả năng thủy phân lông vũ của 4 chủng vi khuẩn chọn lọc đạt từ 75 – 81% sau 4 ngày nuôi cấy lắc. Với kết quả trên hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu của các nhóm nghiên cứu khác khi sử dụng môi trường dinh dưỡng bình thường có bổ
Chuyên ngành Di truyền học 46 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
sung thêm bột lông vũ nuôi cấy chủng vi khuẩn Flavobacterium [61], Vibrio
[48] Chryseobacterium [7,8] với mục đích thu hồi keratnase. Vậy với kết quả này môi trường dinh dưỡng bình thường (MT2) là môi trường thích hợp cho các chủng vi khuẩn thủy phân lông vũ, đồng thời có thể được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo để thu hồi keratinase từ 4 chủng vi khuẩn được chọn lọc. Đây cũng chính là môi trường với hàm lượng dinh dưỡng chủ yếu là các muối, nên giảm được chi phí nghiên cứu.
Như vậy, qua kết quả về sự sinh trưởng và phân huỷ của các chủng trên 3 môi trường (Hình 3.2 và 3.3) thì môi trường dinh dưỡng bình thường - môi trường lông vũ là môi trường thích hợp, chính môi trường này có nhiều điều kiện tốt nhất để các chủng vi khuẩn tăng nhanh về số lượng và thủy phân đạt tỉ lệ cao nhất trong thời gian ngắn nhất.
Hình 3.2: Khả năng sinh trƣởng và thủy phân lông vũ của các chủng vi khuẩn trên các môi trƣờng khác nhau (Sau 4 ngày nuôi lắc)
Chuyên ngành Di truyền học 47 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.3: Khả năng phân huỷ lông vũ của các chủng vi khuẩn trên 3 môi trƣờng khác nhau (Sau 4 ngày nuôi cấy lắc)
3.5. Tối ƣu nhiệt độ của các chủng vi khuẩn chọn lọc
Nhiệt độ nuôi cấy là một trong những yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng sinh trưởng của vi khuẩn. Vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus thường hoạt
động trong khoảng nhiệt độ từ 370
– 400C. Trong khi đó, một số vi khuẩn khác lại hoạt động trong khoảng nhiệt độ thấp hơn từ 250
– 300C như chủng
Chryseobacterium [61] và Vibrio [18, 22]. Kết quả nuôi cấy 4 chủng thấy, khi
thay đổi các khung nhiệt độ khác nhau 250
, 300, 350, 400C thì các chủng vi khuẩn phát triển tốt và sinh hoạt tính thủy phân keratin cao ở khoảng nhiệt độ từ 350 – 400C. Ở điều kiện 350
C và 400C, sau 3 ngày nuôi cấy lắc lượng tế bào đạt từ 7,83 – 8,90 x 106
CFU/ml và trọng lượng lông sau khi thủy phân đạt từ 0,2631 – 0,1854 (Bảng 3.4 và hình 3.4). Theo công thức tính hiệu suất thủy phân, sự thủy phân của 4 chủng này thích hợp với nhiệt độ từ 35– 400C và đạt khoảng 73,69% - 81,46%. So sánh với kết quả của một số nghiên cứu trước
Chuyên ngành Di truyền học 48 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
đây, nhận thấy rằng phần lớn các chủng thuộc nhóm Bacillus đều sinh trưởng và có khả năng sinh keratinase cao ở điều kiện nhiệt độ khoảng 300 – 500
C, pH kiềm (pH8-9) [18, 22].
Bảng 3.4: Mật độ tế bào và khả năng thủy phân 1 gram lông vũ ở các nhiệt độ khác nhau (Sau 4 ngày nuôi lắc)
Ghi chú: 1: Số lượng vi khuẩn (CFU/ml) x 106
; 2: Lượng lông vũ đã sử dụng(g) Chủng Nhiệt độ L.SC.1.2 Đ.SC.1.1 L.GT.2.1 Đ.GT.2.2 1 (x106) 2 1 (x106) 2 1 (x106) 2 1 (x106) 2 250C 5,97 0,4510 ± 0,06 6,34 0,4217 ± 0,08 6,36 0,4356 ± 0,09 6,78 0,4123 ± 0,14 300C 6,13 0,5021 ± 0,10 7,32 0,4154 ± 0,12 7,28 0,4076 ± 0,11 7,30 0,4012 ± 0,09 350C 7,12 0,5607 ± 0,07 7,83 0,4110 ± 0,08 8,07 0,2631 ± 0,08 8,53 0,1854 ± 0,11 400C 7,20 0,5202 ± 0,07 8,21 0,4374 ± 0,08 8,34 0,3450 ± 0,14 8,90 0,1990 ± 0,11
Chuyên ngành Di truyền học 49 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.4: Khả năng phân huỷ lông vũ của các chủng vi khuẩn trên các nhiệt độ khác nhau (Sau 4 ngày nuôi cấy lắc)
3.6. Đặc điểm hình thái nhóm vi khuẩn thuỷ phân lông vũ
Đặc điểm hình thái của vi khuẩn là một trong những đặc điểm để nhận biết chủng vi khuẩn đó thuộc nhóm nào. Tế bào của vi khuẩn có rất nhiều hình dạng và kích thước rất khác nhau tuỳ thuộc vào từng nhóm, từng loài. Với 4 chủng đã được chọn lọc và đem đi nhận biết dưới kính hiển vi, với độ phóng đại 4800 lần, có hình dạng và kích thước của các chủng như sau: (Hình 3.5). Chủng L.GT2.1 có hình que, có từ 2 đến 3 tế bào đi liền với nhau theo dạng chuỗi (A).
Chủng Đ.GT.2.2 hình que lớn, đơn, hoặc ghép đôi, hoặc có thể tạo thành chuỗi (B).
Chủng Đ.SC1.1 dạng hình tròn,dấu phẩy, có chuyển động (C). Chủng L.SC.1.2. có hình dạng trực khuẩn ngắn, chuyển động (D).
Chuyên ngành Di truyền học 50 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
