pET32a
Dùng 2 enzyme cắt giới hạn BamH I; Xho I, cắt mở vòng vector pET32a và đoạn gene keratinase, sau đó sản phẩm được tiến hành tinh sạch và kiểm tra lại trên gel 0, 8% (Hình 3.11).
Chuyên ngành Di truyền học 58 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.11: Sản phẩm tinh sạch Ker và vertor pET 32a sau khi xử lý bằng 2 enzyme cắt.M: marker;1: Ker chủng Đ.NĐ.1.2; 2: Ker chủng L.NĐ.3.4; 3:
Vertor pET 32a.
Theo lý thuyết, vector pET 32a được chọn làm hệ vertor biểu hiện vì vector pET 32a có promoter lai T7/lac, vị trí đa nhân dòng (multi cloning site), và trình tự kết thúc T7. Việc phiên mã từ promoter lai T7/lac đòi hỏi phải có T7 RNA polymerase. Tế bào E. coli chủ có gene mã hóa cho T7 RNA polymerase được đưa vào nhiễm sắc thể bằng công nghệ gene, nhưng protein kìm hãm lac operon, lacI, ức chế biểu hiện gene này. Khi IPTG được thêm
vào, nó cảm ứng việc giải phóng lacI ra khỏi operator của lac operon và quá trình phiên mã được bắt đầu. T7 RNA polymerase sau đó được tạo ra và bám vào promoter lai T7/lac, và protein tái tổ hợp được sản xuất (Hình 3.12).
Hình 3.12: Vertor tái tổ hợp pET 32a/Keratin 3.10.3. Biến nạp sản phẩm lai vào tế bào khả biến DH10B
Lai đoạn gene keratinase sau khi xử lý bằng 2 enzyme cắt BamH I; Xho I vào vertor pET 32a rồi biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH10B [32]. Kết quả sau biến nạp, các khuẩn lạc đã mọc được trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh Ampicillin. Các khuẩn lạc này sẽ chọn lọc để tách plasmid (Hình 3.13).
Chuyên ngành Di truyền học 59 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.13: Sản phẩm biến nạp của 2 chủng vi khuẩn vào tế bào khả biến E.coli DH10B
3.10.4. Tách DNA plasmid tái tổ hợp
DNA plasmid tái tổ hợp được tách chiết với bộ hóa chất QIAprep Spin Plasmid Extraction Kit (QAGEN Inc). Vì số lượng khuẩn lạc mọc rất nhiều nên chúng tôi tiến hành chọn ngẫu nhiên mỗi đĩa 8 khuẩn lạc trắng để kiểm tra sản phẩm sau biến nạp, sau đó điện di trên gel agarose 0.8%. Kết quả được trình bày trên hình 3.14.
Chuyên ngành Di truyền học 60 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.14: Ảnh điện di sản phẩm tách DNAplasmid tái tổ hợp 1- 8: Chủng L.NĐ.3.4
9-16: Chủng Đ.NĐ. 1.2 17: Đối chứng
Quan sát phổ điện di thấy rằng, DNA plasmid của các chủng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp sẽ có kích thước lớn hơn so với DNA plasmid của chủng đối chứng (do chủng DH10B chỉ mang vector pET 32a, không mang gen Ker). Vì vậy, các DNA plasmid có kích thước lớn hơn so plasmid đối chứng sẽ được chọn và kiểm tra lại bằng phản ứng cắt enzyme.
Sản phẩm cắt DNA plasmid được kiểm ta lại bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%. Kết quả điện di thể hiện ở hình 3.15, sản phẩm cắt plasmid xuất hiện 2 băng có kích thước hoàn toàn phù hợp với kích thước của vector pET 32a (khoảng 5.9 kb) và đoạn gen Ker (khoảng 1.2 kb). Kết quả này cho thấy, đoạn gene Ker đã được đưa vào vector pET 32a thành công. Plasmid tái tổ hợp mang gene Ker sẽ được đưa vào biểu hiện ở vi khuẩn E.coli BL21.
Chuyên ngành Di truyền học 61 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.15 Sản phẩm phản ứng cắt DNA plasmid TTH bằng 2 enzyme
XhoI và BamHI
3.11. Đánh giá hoạt tính ezyme dịch thô của chủng chọn lọc
3.11.1. Định lƣợng Protein bằng phƣơng pháp Bradford
Xây dựng đƣờng chuẩn protein
Phương pháp Bradford là một phương pháp xác định nồng độ protein rất nhanh, chính xác và được sử dụng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu protein. Phương pháp Bradford dựa trên sự liên kết của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue G-250 với Protein. Hai loại protein sử dụng là albumin huyết thanh bò (BSA- Bovine serum albumin) và gamma- globulin. Với phương pháp Bradford, mầu thuốc nhuộm phát triển rõ ràng với BSA hơn so với loại protein khác, nên BSA là loại prtein chuẩn được sử dụng phổ biến. Sau khi tiến hành thí nghiệm đã xây dựng đường chuẩn bằng cách đo OD tại bước sóng 595nm của BSA chuẩn ở các nồng độ khác nhau (trình bày ở phần phương pháp 2.2.9). Kết quả thể hiện ở bảng 3.8 và hình 3.16.
Bảng 3.8: Kết quả đo giá trị mật độ quang (OD) của BSA
Chuyên ngành Di truyền học 62 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Y (Giá trị OD/595nm) 0 0,025 0,079 0,125 0,161 0,217
Hình 3.16: Đƣờng chuẩn Bradford
Với phương pháp trên, BSA ở nồng độ 0,1 mg/ml pha loãng với nước thành các nồng độ khác nhau (bảng 3.8), thì giá trị OD595 tăng dần theo nồng độ của BSA. Do đó, ta xây dựng được đường chuẩn protein có dạng y= ax + b với trục tung là giá trị OD và trục hoành là nồng độ của BSA (hình 3.16). Vậy với thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue G-250 phát triển rõ ràng với BSA, đủ điều kiện để tiến xác định hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu.
Xác định hàm lƣợng protein trong mẫu nghiên cứu
Dựa vào đường chuẩn BSA đã xây dựng được ở trên, chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng protein trong dịch nổi của 2 chủng chọn lọc theo phương pháp Bradford với tỷ lệ phản ứng đã nêu phần phương pháp (2.2.9). Kết quả đo khả năng hấp thụ ánh sáng (OD) tại bước sóng 595 nm và hàm lượng protein của 2 chủng chọn lọc được thể hiện ở bảng 3.9. Hàm lượng protein tổng số ở chủng L.NĐ.3.4 là 0.220 mg/ml, trong khi đó hàm lượng protein ở chủng Đ.NĐ.1.2 có hàm lượng protein tổng số là 0.238 mg/ml. Những kết
Chuyên ngành Di truyền học 63 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
SDS PAGE biến tính. Ngoài ra, sẽ giúp cho các nghiên cứu tiếp theo về tinh sạch sản phẩm keratianse.
Bảng 3.9: Kết quả đo mật độ quang (OD) và hàm lƣợng protein của dịch nổi vi khuẩn
Mẫu Giá trị OD595 Hàm lƣợng protein (mg/ml)
L.NĐ.3.4 0,379 0,220
Đ.NĐ.1.2 0,409 0,238
3.11.2. Thử hoạt tính enzyme bằng azokeratin
Xác định hoạt tính keratinase bằng azokeratin là một phương pháp phổ biến và có độ tin cậy cao khi nó có thể xác định chính xác đơn vị hoạt tính keratinase. Sau khi tiến hành phản ứng, dung dịch phản ứng được đo quang phổ ở bước sóng 440nm (Thí nghiệm được lặp lại 3 lần). Kết quả cho thấy dịch thủy phân đối với 2 chủng L.NĐ. 3.4 và Đ.NĐ.1.2 lần lượt là 12,1U và
12,7U (bảng 3.10).
Từ kết quả trên cho thấy 2 chủng L.NĐ.3.4 và Đ.NĐ.1.2 đều có hoạt tính keratinase. Trong đó, chủng L.NĐ.3.4 có hoạt tính là 183,33 cao hơn chủng Đ.NĐ.1.2 là 177,87 được thể hiện ở bảng 3.10. Kết quả có sự chênh lệch hoạt tính giữa 2 chủng có thể do chủng L.NĐ.3.4 phân lập trên lông vũ, còn chủng Đ.NĐ.1.2 thì phân lập trên đất. Do vậy, chủng L.NĐ.3.4 đặc hiệu với azokeratin hơn so với chủng Đ.NĐ.1.2.
Hiện nay trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về hoạt tính keratinase, trong đó có nhóm tác giả Xiang Lin và cộng sự, 1992 [23] xác định được hoạt tính keratinase là 86 U/mg thì kết quả này thấp hơn so với kết quả của chúng tôi. Nhưng so với nhóm tác giả Bin Zhang và cộng sự , 2009
Chuyên ngành Di truyền học 64 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
[66] xác định được hoạt tính keratinase là 980.9 U/mg thì kết quả này lại cao hơn. Vậy khả năng sinh keratinase phụ thuộc vào các chủng vi khuẩn khác nhau. Hai chủng L.NĐ.3.4 và Đ.NĐ.1.2 đã được phân lập có hoạt tính keratinase khá cao. Với kết quả này có thể tiến hành các nghiên cứu tiếp theo và đưa vào ứng dụng trong thực tiễn.
Bảng 3.10. Kết quả xác định hoạt tính keratinase
Tên chủng Thể tích dịch nuôi (ml) Hàm lƣợng protein(mg) Hoạt tính keretinase (U) Hoạt tính keretinase (U/mg) L.NĐ.3.4 200 44 8066,5 183,33 Đ.NĐ.1.2 200 47.6 8466,6 177,87
Chuyên ngành Di truyền học 65 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận
Phân lập và tuyển chọn được 20 chủng vi khuẩn, trong đó chọn lọc được 4 chủng vi khuẩn có khả năng sinh keratinase cao.( Đ.GT.2.2; L.SC.1.2; L.GT.2.1 và Đ.SC.1.1)
- Điều kiện nhiệt độ cho các chủng vi khuẩn này phát triển ở nhiệt độ từ 350- 400C và môi trường nuôi cấy thích hợp cho các chủng vi khuẩn trên là môi trường dinh dưỡng bình thường - MT2, có khả năng thủy phân lông vũ đạt từ 75,45% đến 81,55%, sau 4 ngày nuôi cấy lắc
- Hai chủng Đ.GT.2.2 và L.SC.1.2 được phân loại dựa vào đặc điểm hình thái, kết hợp với các phản ứng sinh hóa (kit chuẩn API 50CHB và 20NE) và phân tích trình tự gene mã hóa 16S rARN. Chủng Đ.GT.2.2 có độ tương đồng 98% so với nhiều loài thuộc chi Bacillus và chủng L.SC.1.2 có độ tương đồng 95% so với chi Pseudomonas.
- Dịch chiết protein thô keratinase của chủng L.NĐ.3.4 có hoạt tính là 183.33 U/mg và Đ.NĐ.1.2 có hoạt tính là 177.87 U/mg, khi sử dụng cơ chất
azokeratin.
- Ngoài ra, chúng tôi đã nhân được đoạn gene keratinase (Ker) và thiết kế được vector tái tổ hợp pET32a mang gene Ker để biểu hiện trong Escherichia
coli.
4.2 Kiến nghị
- Nghiên cứu quá trình tinh sạch keratinase ở dạng thô và tinh để ứng dụng trong chăn nuôi.
Chuyên ngành Di truyền học 66 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt
1. Nguyễn Đình Kim. 2001. Giáo trình vi sinh vật đất.
2. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty. 2002. Vi sinh vật
học. Nhà xuất bản giáo dục.
3. Nguyễn Lân Dũng. 1984. Vi sinh vật đất và sự chuyển hoá các hợp chất
cacbon, nitơ. Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật.
4. Nguyễn Văn Sức. 2000. Vai trò của vi sinh vật đất trong hệ thống nông
nghiệp bền vững. Tài nguyên vi sinh vật đất và sự phát triển bền vững của hệ sinh thái đất. Nhà xuất bản nông nghiệp.
5. GS. Lê Văn Liễn. 2001. Kỹ thuật chế biến, bảo quản sản phẩm phụ giết mổ
và hải sản làm thức ăn chăn nuôi. Viện chăn nuôi.
6. Ngô Xuân Mạnh, Nguyễn Thị Lâm Đoàn, Võ Nhân Hậu, Ngô Xuân Dũng.
2008. Chọn lựa điều kiện nuôi cấy tối ưu vi khuẩn Bacillus licheniformis;
5:460-466. Khoa Công nghệ Thực Phẩm, Trường Đại Học Nông Nghiệp Hà Nội
7. Nguyễn Thu Hiền, Nguyễn Thị Quỳnh Mai, Nguyễn Huy Hoàng. 2010. Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn Chryseobacterium có khả năng thủy
phân lông vũ; 8(3A):923-928. Tạp chí Công nghệ sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
8. Nguyễn Huy Hoàng, Nguyễn Thu Hiền, Nguyễn Thị Quỳnh Mai. 2010. Phân loại và đánh giá khả năng thủy phân lông vũ của các chủng vi khuẩn
Bacillus.sp. Phân lập từ đất ở nơi giết mổ gia cầm; 8(4):1869-1875. Tạp chí Công nghệ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện KH & CN Việt Nam.
Chuyên ngành Di truyền học 67 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
9. Andersson M., Laukkanen M., Nurmiaho-Lassila E.L., Rainey F.A.,
Niemela S. L., Niemelü S. L., Sankinoja-Sanolen M.S. 1995. Bacillus thermosphaericus, sp. Nov, a new thermosphilic ureolytic Bacillus isolated from air. Syst Appl microbio; 18: 203-220 .
10. De Boer S. A., Priest F G., Diedrichsen B. 1994. On the industrial use of
Bacillus licheniformis: a review. Appl Microbiol Biotechnol; 40:595-598.
11. Galvez A., Valdivia E., Gonzalez-Segura A., Lebbadi M., Martinez-Bueno
M., Maqueda M. 1993. Purification, characterization and lytic activity against Naegleria fowleri of two amoebocins produced by Bacillus
licheniformis A12. Appl Environ Microbiol; 59:1480–1486.
12. Palleroni N. J. 1984., Genus Bacillus. In Krieg., N.R., & Holt, J.G (eds):
Bergey ,s Manual of Systematic Bacteriology. The Williams and Wilkin Co., Baltimore.
13. Zerdani I., Faid M., Malki A. 2004. Feather wastes digestion by new
isolated satrain Bacillus sp in Morocco. Afr Biotechnol; 3:67-70.
14. Molyneux G.S. 1959. The digestion of wool by a keratinolytic Bacillus.
Aus. J.Biol. Sci; 12:274-281.
15. Schmidt W.F. 1998. Innovative feather utilization strategies. National
Poultry Waste Management Symposium, Springdale, Arkansas. Auburn, AL: Auburn University Printing Services; 276-282.
16. Schmidt W.F., Line M.J. 1996. Physical and chemical structures of
poultry feather fiber fractions in fiber process development. In: Proceedings of the TAPPI Nonwovens Conference, 11–13 March 1996, Charlotte, North Carolina. Atlanta, GA: Technical Association of the Pulp and Paper Industry; 135-140.
17. Shih J.C.H. 1993. Recent developments in poultry waste digestion and
Chuyên ngành Di truyền học 68 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
18. Brandelli A. 2005. Production of an extracellular keratinase from
Chryseobacterium sp. growing on raw feathers. J Biotechnol; 35-37.
19. Palleroni N. J. 1984. Genus bacillus. In Krieg, N.R., & Holt, J.G (eds):
Bergey ,s Manual of Systematic Bacteriology. The Williams and Wilkin Co., Baltimore.
20. Araragi T., Andersson M .A., Mikkola R. 1979. Density of
microorganisms in soil. Appl microbiol biotechnol; 57-61.
21. Williams C.M., Richtcr C.S., Mackenzie J.R and Shih J.C.I. 1990. Isolation, identification and characterization of a feather-degrading bacterium. J Appl Environ Microbiol; 56:1509-1515.
22. Lin X., Lee C.G., Casale SE and Shih J.C. 1992. Purification and
characterization of a keratinase from a feather degrading Bacillus Licheniformis strain. J Appl Environ Ailcrobiol; 58:3271-3275.
23. Xiang Lin.,Chung-Ginn Lee., Ellen S., Jason C. H. 1992. Purification and
Characterization of a Keratinase from a Feather-Degrading Bacillus
licheniformis strain. J Appl Environ Ailcrobiol; 58(10):3271–3275.
24. Gupta R., Ramnani P. 2006. Microbial keratinases and their prospective
applications: an overview. Appl microbiol biotechnol; 70:21-33.
25. Egrow N.X. 1983. Microbiology practice. Mir Publishers, Moxcova.
26. Zhang B., Sun Z., Jiang D., Niu T G. 2009. Isolation and purification of alkaline keratinase from, African Journal of Biotechnology Vol. 8; 11:2598- 2603.
27. Tamilmani P., Umamaheswari A., Vinayagam A. B. 2008. Production of
Chuyên ngành Di truyền học 69 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Isolated from Poultry Farm Soilin Namakkal District (Tamilnadu), Prakash International Journal of Poultry Science 7; 2:184-188.
28. Lin X., Lee C.G., Casale E.S., Shih J.C.H. 1992. Purification and
characterization of a keratinase from a feather-degrading Bacillus licheniformis strain, Appl. Environ. Microbiol., 58: 3271-3275.
29. Radha S., Gunasekaran P. 2007. Cloning and expression of keratinase
gene in Bacillusmegaterium and optimization of fermentation conditions for the production of keratinase by recombinant strain, Journal application microbiol; 103:1301–1310.
30. Godde C., Sahm K., Brouns S.J.J., Kluskens L.D., van der Oost J., de Vos
W.M., Antranikian G. 2005.Cloning and expression of islandisin,a new thermostable subtilis in from Fervidobacteriumislandicum, in Escherichiacoli, Appl. Environ.Microbiol; 71:3951–3958.
31. Joo H S.; Kumar C.G.; Park G.C.; Kim K.T, Paik S.R. and Chang C.S.
October 2002. Optimization of the production of an extracellular alkaline protease from Bacillus hirikoshii. Process Biochemistry, vol. 38; 2:155-159.
32. Sambrook, Fritsch E.F., Maniatis T. 2001. ’’Moleculer Cloning:
Alaboratory manual’’. Cold spring Harbor Lab. Press, Cold spring Harbor.
33. W. Akhtar., H.G. Edwards. 1997. Fourier-transform Raman spectroscopy
of mammalian and avian keratotic biopolymers Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc; 53A:81-90.
34. L. Kreplak., J. Doucet., P. Dumas., F. Briki. 2004. New aspects of the
alpha-helix to beta-sheet transition in stretched hard alpha-keratin fibers Biophys J; 87:640-647.
35. I. Zerdani., M. Faid., A. Malki. 2004. Feather wastes digestion by new isolated strains Bacillus sp. in Morocco. Afr J Biotechnol; 3: 67-70.
Chuyên ngành Di truyền học 70 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
36. M.C. Papadopoulos. 1986. The effect of enzymatic treatment on amino
acid content and nitrogen characteristics of feather meal. Anim Feed Sci Technol; 16:151-156.
37. J.J. Noval., W.J. Nickerson. 1995. Decomposition of native keratin by
Streptomyces fradiae J Bacteriol; 77:251-263.
38. B. Bockle., R. Muller. 1997. Reduction of Disulfide Bonds by Streptomyces
pactum during Growth on Chicken Feathers Appl Environ Microbiol; 63:790- 792.
39. P. Ramnani., R. Gupta. 2004. Optimization of medium composition for
keratinase production on feather by Bacillus licheniformis RG1 using statistical