Các thiết bị được sử dụng đặt tại Phòng Vi sinh vật đất và Phòng Thí nghiệm Trọng điểm, Viện Công nghệ Sinh học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.1.4. Môi trƣờng nuôi cấy
2.1.4.1. Môi trƣờng Broth Peptone [16]
Chuyên ngành Di truyền học 21 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Na2HPO4 3,5 g H2O 1000 ml
KH2PO4 1,5 g pH 7,2 ±0,2
2.1.4.2. Môi trƣờng I
Môi trường để phân lập chủng Bacillus licheniformic [12]
NaCl 0,5 g Nấm men 0,1 g NH4Cl 0,5 g Bột lông vũ 10 g K2HPO4 0,3 g Thạch 20 g KH2PO4 0,4 g H2O 1000 ml MgCl2.6H2O 0,1 g pH 8,0 2.1.4.3. Môi trƣờng II
Môi trường để phân lập chủng Vibrio [17]
2.1.4.4. Môi trƣờng III
Môi trường để phân lập chủng Chryseobacterium [16]
NaCl 0,5 g Bột lông vũ 10 g
K2HPO4 0,3 g Thạch 20 g
KH2PO4 0,4 g H2O 1000 ml
pH 7,0
2.1.4.5. Môi trƣờng đệm Phosphate – buffered – Saline [17]
NaCl 8,00 g KH2PO4 0,27 g
NaCl 0,5 g Bột lông vũ 15 g
K2HPO4 0,3 g Thạch 20 g
KH2PO4 0,4 g H2O 1000 ml
Chuyên ngành Di truyền học 22 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
KCl 0,20 g H2O 1000 ml
Na2HPO4 1,44 g pH 7,4
2.1.4.6. Môi trƣờng nuôi lắc lông vũ [12, 16, 17]
NaCl 0,5 g Lông vũ 20 g K2HPO4 0,3 g H2O 1000 ml KH2PO4 0,4 g pH 7 – 7,2 2.1.4.7. Môi trƣờng MPA [23] NaCl 5 g Thạch 20 g Pepton 10 g H2O 1000 ml Cao Thịt 3 g pH 7,2- 7,3
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phân lập chủng vi khuẩn có khả năng sinh keratinase cao 2.2.1.1. Lấy mẫu và đo pH đất 2.2.1.1. Lấy mẫu và đo pH đất
Lấy mẫu
Loại bỏ lớp dất dày 2-3 cm trên bề mặt. Sau đó dùng dao hay xẻng để lấy những tảng đất theo độ sâu của lớp đất nghiên cứu. Các mẫu đất và lông lấy được cho vào túi li lông tiến hành phân tích ngay hoặc được bảo quản ở 40
C.
Đo pH đất
Cân 18,64 gram KCl và 20 gram đất cho vào bình đựng 250 ml H2O cất. Cân 20 gram mẫu đất cho vào 2 bình tam giác 100ml:
+ Bình 1 cho 50ml nước cất (Đo pH bề mặt)
+ Bình 2 cho 50ml dung dịch KCl (Đo pH trong đất)
Lắc cho tan mẫu với vận tốc 200 vòng/ phút trong 10 phút. Sau đó để tĩnh 24h rồi tiến hành đo giá trị pH của đất.
2.2.1.2. Phân lập chủng vi khuẩn Chryseobacterium
Từ các mẫu lông thu được, cân 10 gram lông ủ trong môi trường broth peptoneở 24h, 30oC. Sau đó lấy 1ml dịch nuôi cho vào 90 ml nước vô trùng
Chuyên ngành Di truyền học 23 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
(độ pha loãng 10-1). Dùng pipet vô trùng hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm có chứa sẵn 9 ml môi trường nước muối sinh lý vô trùng (độ pha loãng là 10-2
), thay pipet tiếp tục hút 1 ml dung dịch vừa pha loãng sang ống tiếp theo. Tiếp tục làm như vậy ta sẽ được các dung dịch pha loãng 10-3
, 10-4, 10-5.., hút 0,05 ml dịch pha loãng trải ra đĩa thạch chứa môi trường III. Mỗi nồng độ pha loãng được lặp lại 3 lần và được nuôi ở 30oC. Sau 24, 48 giờ số lượng khuẩn lạc được đếm bằng mắt thường và tiến hành chọn khuẩn lạc theo hình thái riêng.
2.2.1.3. Phân lập chủng vi khuẩn Vibrio
Từ các mẫu lông thu được, cân 10 gram lông đưa vào môi trường đệm Phosphate – buffered – Saline (PBS) → lắc 20 - 30 phút, 200v/p. Sau đó lấy 1ml dịch nuôi cho vào 90 ml nước vô trùng (độ pha loãng 10-1
). Dùng pipet vô trùng hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm có chứa sẵn 9 ml môi trường nước muối sinh lý vô trùng (độ pha loãng là 10-2), thay pipet tiếp tục hút 1 ml dung dịch vừa pha loãng sang ống tiếp theo. Tiếp tục làm như vậy ta sẽ được các dung dịch pha loãng 10-3
, 10-4, 10-5.., hút 0,05 ml dịch pha loãng trải ra đĩa thạch chứa môi trường II. Mỗi nồng độ pha loãng được lặp lại 3 lần và được nuôi ở 37oC. Sau 24, 48 giờ số lượng khuẩn lạc được đếm bằng mắt thường và tiến hành chọn khuẩn lạc theo hình thái riêng.
2.2.1.4. Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus
Từ các mẫu đất thu được ta nghiền nhỏ, cân 10 gram cho vào 90 ml nước vô trùng (độ pha loãng 10-1) → lắc 30’, 200v/p. Sau đó dịch mẫu được xử lý sốc nhiệt ở 80oC trong thời gian 10 phút. Dùng pipet vô trùng hút 1 ml mẫu đã được ủ ở 80oC trong 10 phút cho vào ống nghiệm có chứa sẵn 9 ml môi trường nước muối sinh lý vô trùng (độ pha loãng là 10-2), thay pipet tiếp tục hút 1ml dung dịch vừa pha loãng sang ống tiếp theo. Tiếp tục làm như vậy ta sẽ được các dung dịch pha loãng 10-3
Chuyên ngành Di truyền học 24 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
0,05 ml dịch pha loãng trải ra đĩa thạch chứa môi trường I. Mỗi nồng độ pha loãng được lặp lại 3 lần và được nuôi ở 37oC. Sau 24, 48 giờ số lượng khuẩn lạc được đếm bằng mắt thường và tiến hành chọn khuẩn lạc theo hình thái riêng.
2.2.2. Xác định khả năng thuỷ phân lông vũ 2.2.2.1. Nuôi giống cấp 1 vào môi trƣờng MPA 2.2.2.1. Nuôi giống cấp 1 vào môi trƣờng MPA
Cách tiến hành:
- Pha môi trường MPA (đã nêu ở phần 2.1.4.7).
- Dùng que cấy giống, hơ phần đầu của que cấy giống trên trên ngọn lửa đèn cồn cho cháy đỏ rực. Sau đó đưa qua đưa lại phần thân của que cấy trên trên ngọn lửa đèn cồn để vô trùng tuyệt đối→ Làm nguội que cấy→ Lấy 1 ít chủng trong ống nghiệm đưa vào các bình môi trường, đồng thời giũ mạnh que cấy để cho tất cả chủng giống được cấy vào môi trường → Ghi tên chủng và ngày cấy ngoài vỏ bình → Đem đi nuôi lắc qua đêm, ở nhiệt độ 30oC với vận tốc 200 vòng/phút.
(Lưu ý: Khi lấy chủng phải thật khéo không được để chạm vào thành ống nghiệm và khi mở nắp bình phải hơ miệng bình môi trường và nút bông qua ngọn lửa đèn cồn để tránh nhiễm khuẩn).
Cấy giống cấp 1 vào bình môi trường nuôi lắc có bổ sung lông vũ
Cách tiến hành:
- Pha môi trường nuôi lắc lông vũ (đã nêu ở phần 2.1.4.6).
- Dùng pipet thuỷ tinh lấy 0,5 ml giống cấp 1 cho vào bình môi trường (mỗi bình 1% giống). Mỗi chủng giống cấy vào 1 bình. Sau đó đem đi nuôi lắc cùng với bình đối chứng ở 30o
C - 35oC, với tốc độ 200 vòng/phút, trong khoảng thời gian là 3-5 ngày.
- Pha loãng và cấy trải giống cấp 1, theo dõi các chủng giống qua các ngày nuôi cấy.
Chuyên ngành Di truyền học 25 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Đo pH, nhận xét của từng chủng nuôi cấy.
- Xác định trọng lượng lông còn lại sau thời gian nuôi lắc (Làm khô lông và cân khối lượng còn lại sau nuôi cấy lắc) → xác định tỉ lệ % về khả năng thuỷ phân lông vũ của các chủng vi khuẩn theo công thức:
A (%) = 100% BĐ C BĐ m m m
A (%): Tỉ lệ phần trăm về sự thuỷ phân của các chủng
mBĐ: Trọng lượng lông vũ ban đầu.
mC: Trọng lượng lông vũ còn lại sau thời gian nuôi cấy lắc.
→ Chọn lọc các chủng vi khuẩn có khả năng thủy phân keratin mạnh nhất (sinh keratinase cao).
2.2.2.2. Xác định mật độ tế bào
Mật độ tế bào vi khuẩn sau khi pha loãng và cấy trải trên môi trường được tính bằng công thức:
Y = a x 20 x 10n
Y: Số khuẩn lạc thu được trên 1 ml dịch. a: Số khuẩn lạc thu được trên đĩa thạch. 20: (1000 µl/50 µl)
10n: Độ pha loãng mẫu.
2.2.3. Lựa chọn môi trƣờng thích hợp cho các chủng vi khuẩn có khả năng sinh keratinase cao
Các chủng vi khuẩn đã được tuyển chọn là những vi khuẩn có khả năng thuỷ phân lông vũ tốt nhất. Sau đó đem đi thử nghiệm trên các môi trường khác nhau với mục đích là tìm ra môi trường thích hợp và có giá trị kinh tế. Chuẩn bị môi trường để cấy chủng bao gồm: Môi trường giàu dinh dưỡng (môi trường MPA), môi trường dinh dưỡng bình thường (môi trường khoáng) và môi trường nghèo dinh dưỡng (môi trường nước).
Chuyên ngành Di truyền học 26 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Cách tiến hành: các bình môi trường làm như phần phương pháp nghiên cứu
(2.2.2.1).
- Cấy giống cấp 1 vào các bình thử môi trường nuôi lắc có bổ sung lông vũ
Cách tiến hành: làm như phần phương pháp nghiên cứu (2.2.2.1).
- Sau đó:
+ Xác định mật độ của chủng vi khuẩn. + Đo pH dịch nuôi
+ Nhận xét sự thuỷ phân của từng chủng trên mỗi môi trường sau nuôi cấy → Cân khối lượng lông còn lại sau 4 ngày nuôi cấy.
2.2.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH lên khả năng sinh trƣởng của vi khuẩn thủy phân lông vũ
Các chủng vi khuẩn đã chọn lọc là có khả năng thuỷ phân lông vũ tốt nhất,
được thử nghiệm trong cùng môi trường lông vũ trên các khung nhiệt độ khác
nhau với mục đích là tìm ra nhiệt độ thích hợp. Khi tìm được nhiệt độ thích
hợp với từng chủng thì giúp các chủng đó có khả năng thuỷ phân lông vũ tốt
nhất.
Các chủng được thử trên các khung nhiệt độ là: 25o
C, 30oC, 35oC và 40oC. Chuẩn bị giống cấp 1, cấy giống cấp 1 vào các bình môi trường làm như phần phương pháp nghiên cứu (2.2.2.1). Sau đó, pha loãng để đếm mật độ giống cấp 1 sau 3 ngày nuôi lắc. Đo pH, nhận xét sự thuỷ phân của từng chủng trên mỗi nhiệt độ sau từng ngày nuôi cấy. Cân khối lượng lông còn lại của từng chủng trên các nhiệt độ sau 3 ngày nuôi cấy.
2.2.5. Xác định đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn
Các chủng vi khuẩn được ria sạch trước 24 h, đưa lên lam kính đã nhỏ sẵn 1 giọt muối sinh lý. Đánh tan sinh khối rồi đậy lam men lên. Sau đó, các chủng vi khuẩn được đem lên kính hiển vi để nhận biết về hình dạng, kích thước tế bào.
Chuyên ngành Di truyền học 27 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.2.6. Xác định gram âm và gram dƣơng của vi khuẩn 2.2.6.1. Phƣơng pháp Hucker cải tiến
Vật liệu và hoá chất:
Dung dịch tím kết tinh (crystal violet)
- Cân 2g tím kết tinh hoà tan trong 20 ml etanol 95% và 0,8 g amon oxalat hoà tan trong 80 ml nước cất. Sau đó trộn hai dịch lại với nhau, giữ 48 giờ rồi lọc. Bảo quản trong lọ tối, sử dụng vài tháng.
Dung dịch Iod:
- Hoà tan 1 g Iod (Iodine) trong 3-5 ml nước cất, thêm 2 g KI (kali iodie) khuấy cho tan hết, cho đủ 300 ml nước cất. Bảo quản trong lọ tối.
Dung dịch tẩy màu:
Etanol 95% hoặc trộn 70 ml etanol 95% với 30 ml aceton. Dung dịch nhuộm bổ sung:
- Chuẩn bị sẵn dung dịch safannin 2,5% trước khi dùng pha với nước cất theo tỉ lệ 1: 5, để có được dung dịch 0,5%.
Các bước tiến hành:
- Chuẩn bị vết bôi: Dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy 24 giờ) hoà vào giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí.
- Cố định tế bào:
+ Hơ nhanh vết bôi qua ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần.
+ Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh trong một phút, rửa nước và thấm khô.
+ Nhuộm lại bằng dung dịch Iod trong một phút, rửa nước và thấm khô. + Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu) rửa nước và thấm khô.
+ Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safrannin trong 2-3 phút, rửa nước, để khô trong không khí.
Chuyên ngành Di truyền học 28 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
+ Soi kính: Dùng vật kính 100X Kết quả:
+ Vi khuẩn gram dương bắt màu tím. + Vi khuẩn gram âm bắt màu đỏ.
2.2.6.2. Xác định bằng cách kiểm tra độ kết dính
Lấy một vòng que cấy sinh khối tế bào đã được ria sạch sau 24 giờ cho lên lam kính đã có 1 giọt KOH 3%. Đánh tan sinh khối, trong khi làm tan sinh khối thì nhấc que cấy để kiểm tra độ kết dính. Kết quả:
+ Với các chủng mà độ kết dính nhớt thì kết luận chủng vi khuẩn đó là gram âm (G-).
+ Với chủng mà độ kết dính không nhớt thì kết luận chủng vi khuẩn đó là
gram dương (G+
).
2.2.7. Phƣơng pháp phân loại vi khuẩn theo đặc tính sinh hoá
Chủng phân lập được chọn lọc và tiến hành phân loại bằng kit chuẩn sinh hoá API 50 CHB và 20 NE, quá trình phân loại được tiến hành theo chỉ dẫn của nhà cung cấp.
Phương pháp thử API 50 CHB dùng để xác định nhóm vi khuẩn thuộc
Gram dương (G+
)
Đây là phương pháp dùng 49 nguồn carbonhydrat để lên men (API 50 CHB) và nhận biết vi khuẩn Bacillus trong đó có các phản ứng với các chất
biết từ trước, thử các phản ứng và tra bảng đối chiếu với khoá phân loại để tìm ra tên loài của chủng. Chỉ dùng một khuẩn lạc sạch để thử phản ứng. 49 phép thử sinh hoá API 50 CHB được trình bày ở bảng 2.1.
Bảng 2.1: 49 phép thử lên men API 50 CHB
STT Phép thử Cơ chất STT Phép
thử
Cơ chất
0 CTL Control 25 ESC Esculine
1 GFL Glycerol 26 SAL Salicine
Chuyên ngành Di truyền học 29 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3 DARA D-Arabinose 28 MAL Maltose
4 LARA L-Arabinose 29 LAC Lactose
5 RIB Ribose 30 MEL Melibiose
6 DXYL D-Xylose 31 SAC Saccharose
7 LXYL L-Xylose 32 TRE Trehalose
8 ADO Adonitol 33 INU Inuline
9 βMXL β Methyl-xyloside 34 MLZ Melezitose
10 GAL Galactose 35 DRAF D-Rafinose
11 DGLU D-Glucose 36 AMI Amidon
12 DFRU D-Fructose 37 GLY Glycogene
13 DMAN D-Mannose 38 XLT Xylitol
14 LSBE L-Sorbose 39 BGEN Β-Gentiobiose
15 RHA Rhamnose 40 DTUR D-Turanose
16 DUL Dulcitol 41 DLYX D-Lyxose
17 INO Inositol 42 DTAG D-Tagatose
18 MAN Mannitol 43 DFUC D-Fucose
19 SOR Sorbitol 44 LFUC L-Fucose
20 αMDM α Methyl-D- mannoside 45 DARA D-Arabitol 21 α MMG α Methyl-D- glucoside 46 LARA L-Arabitol 22 NAG N-Acetyl glucosamine 47 GNT Gluconate
23 AMY Amygdaline 48 2CG 2 ceto-gluconate
24 ARB Arbutine 49 5CG 5 ceto-gluconate
Cách tiến hành:
- Làm ẩm phiến thử bằng nước cất vô trùng.
- Hoà tan 1 khuẩn lạc vào 1 ml dung dịch muối sinh lý sao cho độ đục (OD) đạt khoảng 0,3.
-Lấy 0,3 ml dịch trên cho vào 5 ml dung dịch muối sinh lý và lấy 0,6 ml cho vào môi trường 50 CHB.
- Dùng pipet để cấy huyền phù vi khuẩn từ môi trường 50 CHB/E vào 50 giếng của bộ kit 50 CHB.
Chuyên ngành Di truyền học 30 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Trong quá trình tiến hành không để các bọt khí hình thành trong các giếng thử.
- Phủ parafin lên các giếng của bộ kit 50 CHB.
- Đặt kit thử vào tủ ấm 30oC, đọc kết quả sau 24 giờ và 48 giờ. - Tra bảng đối chiếu với khoá phân loại để tìm ra tên loài của chủng.
Phương pháp thử API 20NE dùng cho các trực khuẩn gram âm (G-
), không
có nhu cầu dinh dưỡng đặc biệt
Đây là phương pháp dùng 20 phép thử hóa sinh để nhận biết vi khuẩn gram âm trong đó có các phản ứng với các chất đã biết từ trước, thử các phản ứng và tra bảng đối chiếu với khóa phân loại(bảng chỉ số Analytical Profile
