Hai phương pháp xác định gram tuy khác nhau nhưng đều dựa trên nguyên tắc là dùng các chất hoá học hay thuốc nhuộm tác động đến lớp peptidoglycan ở thành tế bào nên đều đưa đến những kết quả giống nhau và điều này đã có ý nghĩa rất lớn trong việc định tên chủng vi khuẩn.
Ở phương pháp thứ nhất, sau khi tiến hành nhuộm xong, đem soi kính hiển vi thì có 2 chủng vi khuẩn bắt màu màu tím và 2 chủng còn lại thì bắt màu đỏ. Ở phương pháp thứ hai, các tế bào sau khi được đánh tan trong dung dịch KOH 3% và kiểm tra độ nhớt của dịch tế bào thì có 2 chủng độ kết dính không nhớt và 2 chủng còn lại thì độ kết dính rất nhớt.
Như vậy, từ kết quả của cả hai phương pháp đã đưa ra ta có kết luận về gram của các chủng (Bảng 3.5) như sau:
Bảng 3.5: Kết quả xác định gram Chủng vi khuẩn Gram(G) Đ.GT.2.2 Gram dương ( G+ ) L.GT.2.1 Gram dương (G+ ) L.SC.1.2 Gram âm (G- )
Chuyên ngành Di truyền học 51 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Đ.SC.1.1 Gram âm (G- )
3.8. Phân loại các chủng phân lập theo phƣơng pháp sinh hoá 3.8.1. Phân loại theo kit API 50CHB của chủng vi khuẩn Đ.GT.2.2
Kết quả xác định phản ứng hoá sinh đối với chủng Đ.GT.2.2, được so sánh với bảng thống kê quốc tế Analytical Profile Index, 5th
edition, BioMerieux S.A, 1992, tương ứng với loài Bacillus licheniformis. Như vậy,
bằng phương pháp phân loại sử dụng kit chuẩn sinh hóa API 50 CHB, chủng vi khuẩn Đ.GT.2.2 được xác định là loài Bacillus licheniformis và có độ tương đồng 78,3%, được trình bày ở bẳng 3.6.
Bảng 3.6: Kết quả phép thử sinh hóa theo kit API 50CHB của chủng vi khuẩn Đ.GT.2.2 TT Cơ chất Chủng Đ.GT.2.2 TT Cơ chất Chủng HY Đ.GT.2.2 24 giờ 48 giờ 24 giờ 48 giờ 0 Control - - 25 Esculine + + 1 Glycerol + + 26 Salicine + + 2 Erythritol - - 27 Cellobiose + + 3 D-Arabinose - - 28 Maltose + + 4 L-Arabinose +- + 29 Lactose + + 5 Ribose +- + 30 Melibiose - + 6 D-Xylose +- + 31 Saccharose + + 7 L-Xylose - - 32 Trehalose + + 8 Adonitol - - 33 Inuline - - 9 β Methyl-xyloside - - 34 Melezitose - - 10 Galactose - - 35 D-Rafinose +- + 11 D-Glucose + + 36 Amidon +- + 12 D-Fructose + + 37 Glycogene +- + 13 D-Mannose + + 38 Xylitol - - 14 L-Sorbose - - 39 Β Gentiobiose + + 15 Rhamnose +- + 40 D-Turanose - -
Chuyên ngành Di truyền học 52 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
16 Dulcitol - - 41 D-Lyxose - - 17 Inositol +- + 42 D-Tagatose - - 18 Mannitol + + 43 D-Fucose - - 19 Sorbitol + + 44 L-Fucose - - 20 α Methyl-D- mannoside - - 45 D-Arabitol - - 21 α Methyl-D- glucoside + + 46 L-Arabitol - - 22 N Acetyl glucosamine + + 47 Gluconate - - 23 Amygdaline + + 48 2 ceto-gluconate - - 24 Arbutine + + 49 5 ceto-gluconate - -
Ghi chú: ―+‖: có kết quả; ―-―: không có kết quả; ―+ -―: kết quả yếu
3.8.2. Phân loại theo kit API 20NE của chủng vi khuẩn L.SC.1.2
Kết quả xác định phản ứng hoá sinh đối với chủng L.SC.1.2, được xác định với mã số 0150057. Đối chiếu bảng chỉ số Analytical Profile Index, 5th edition, BioMerieux S.A, 1992, mã số 0150057 tương ứng với loài
Pseudomonas pertida. Như vậy, bằng phương pháp phân loại sử dụng hệ
thống API 20NE, chủng vi khuẩn L.SC.1.2 được xác định là loài
Pseudomonas pertida và có độ tương đồng 89,4%, được trình bày ở bảng 3.7.
Bảng 3.7: Kết quả phép thử sinh hóa theo kit API 20NE chủng vi khuẩn L.SC.1.2 TT Phép thử Cơ chất Chủng L.SC.1.2 24 giờ 48 giờ 1 NO3/N2 KNO3 - - 2 TRP Tryptophan - - 3 GLU Glucose - - 4 ADH Arginin + + 5 URE Ure - - 6 ESC Esculin - - 7 GEL Gelatin + + 8 PNPG p – nitrophenyl β- D- - -
Chuyên ngành Di truyền học 53 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
galactosepyranosit 9 GLU Glucose + + 10 ARA Arabinose - - 11 MNE Mannose - - 12 MAN Mannitol +- - 13 NAG N- acetyl-glucosamin -+ - 14 MAL Malat -+ - 15 GNT Gluconat - - 16 CAP Caprat + - 17 ADI Adipat - - 18 MLT Maltose + + 19 CIT Citrat + + 20 PAC Phenyl-axetat + + 21 OX + +
3.9. Phân loại theo kiểu gene
Phân loại theo kiểu gene được phân tích trình tự nucleotit gene 16S rARN từ chủng được tuyển chọn ở trên.
3.9.1. Tách DNA tổng số
DNA tổng số của 2 chủng chọn lọc được tiến hành tách chiết và tinh sạch theo phương pháp của Masterson và cộng sự [32]. Kết quả điện di thể hiện ở hình 3.6.
Chuyên ngành Di truyền học 54 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.6: Ảnh điện di DNA tổng số.
M: marker; 1: DNA tổng số của chủng Đ.GT.2.2; 2: DNA tổng số của chủng
L.SC.1.2.
Kết quả điện di đồ cho thấy DNA tổng số của 2 chủng L.SC.1.2 và Đ.GT.2.2 đã được thu nhận thể hiện độ tinh sạch cao (hình 3.6), DNA được tách chiết không bị gãy vụn, ARN đã loại bỏ được hoàn toàn. Như vậy, sản phẩm DNA tổng số đảm bảo yêu cầu chất lượng cho phản ứng PCR.
3.9.2. Nhân đoạn gene mã hóa 16S rARN bằng kỹ thuật PCR
Đoạn gene 16S rARN của 2 chủng L.SC.1.2 và Đ.GT.2.2 được nhân lên từ DNA tổng số bằng kĩ thuật PCR, sử dụng cặp mồi 16S F: 5’-
CGGAATTCATTGCTGGACCTG-3’; và 16S R: 5’-
GTCCTAGAGCTTTGCTTTAGG-3’. Đoạn gene được nhân lên có kích thước dài khoảng 1,5 kb. Sau khi kết thúc phản ứng PCR, sản phẩm phản ứng được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% kết quả được thể hiện ở hình 3.7.
Hình 3.7: Sản phẩm PCR bằng mồi 16S 1: Chủng Đ.GT.2.2; 2: Chủng L.SC.1.2.
Chuyên ngành Di truyền học 55 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hiện nay, nhờ sự phát triển của ngân hàng dữ liệu gene lớn trên toàn thế giới, phương pháp phân tích trình đoạn gene 16S rRNA để định loại các chủng vi khuẩn đã trở nên rất phổ biến và có độ chính xác cao. Trong nghiên cứu này tiếp tục tiến hành nhân đoạn gene 16S rRNA (độ dài khoảng 1,5 kb) và tiến hành đọc trình tự gene trực tiếp từ sản phẩm PCR từ hai chiều của đoạn gene. Đối với chủng L.SC.1.2, đoạn gene sau khi đọc trình tự và phân tích có kích thước là 1390 bp, chủng Đ.GT.2.2, đoạn gene sau khi đọc trình tự và phân tích có kích thước là 1110 bp. Kết quả phân tích cây phát sinh chủng loại của 2 chủng vi khuẩn trên (hình 3.8) và so sánh với các gene 16S rRNA trong ngân hàng gene quốc tế (GenBank) cho thấy hai đoạn gene này có độ tương đồng cao từ 95 - 98% với nhiều loài thuộc chi Bacillus và chi
Pseudomonas. Kết quả phân tích 16S rRNA này hoàn toàn phù hợp với kết
quả hóa sinh.
Hình 3.8: Cây phát sinh chủng loại của 2 chủng L.SC.1.2 và Đ.GT.2.2
3.10. Chọn dòng gene keratinase vào vector biểu hiện pET32a 3.10.1. Nhân đoạn gene keratinase bằng kỹ thuật PCR 3.10.1. Nhân đoạn gene keratinase bằng kỹ thuật PCR
Chuyên ngành Di truyền học 56 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
So sánh với kết quả phân lập của phòng Vi sinh vật Đất – Viện Công nghệ Sinh học, hai chủng Đ.GT2.2 và L.SC1.1 có khả năng thủy phân lông vũ không tốt bằng 2 chủng Bacillus sp. L.NĐ 3.4; Bacillus sp. Đ.NĐ 1.2 (trong
bộ chủng đã phân lập của phòng). Vì thế, để đạt được kết quả biểu hiện vector tái tổ hợp tốt nhất, gene Ker từ hai chủng Bacillus sp. L.NĐ 3.4; Bacillus sp. Đ.NĐ 1.2 đã được lựa chọn để tiến hành tách dòng và thiết kế vector biểu hiện.
Đoạn gene keratinase được nhân lên từ ADN tổng số nhờ phản ứng PCR sử dụng cặp mồiđặc hiệu:
Primer Ker -F: 5’-CGT GGG ATC CAA AAA ATT GTG GAT CAG C- 3’ Primer Ker -R: 5’- TTA TTC TCG AGC TGC TTG TAC GTT GAT - 3’ Cặp mồi này sẽ nhân được đoạn gene dài khoảng 1,2 kb. Sản phẩm phản ứng được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% được thể hiện ở hình 3.9. Sản phẩm PCR là một băng khá đặc hiệu, không xuất hiện băng phụ, kích thước của đoạn băng trên gel khoảng 1.2 kb, hoàn toàn phù hợp với kích thước theo lý thuyết. Phần gel chứa đoạn gene mong muốn được thôi gel và tinh sạch bằng bộ kit GeneJETTM
Chuyên ngành Di truyền học 57 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.9: Sản phẩm PCR bằng cặp mồi Ker F và Ker R
Hình 3.10: Sản phẩm thôi gel tinh sạch gene keratinase M: marker;1: Chủng Đ.NĐ.1.2;2: Chủng L.NĐ.3.4
3.10.2. Gắn sản phẩm PCR đã thôi gel tinh sạch vào vector tách dòng pET32a pET32a
Dùng 2 enzyme cắt giới hạn BamH I; Xho I, cắt mở vòng vector pET32a và đoạn gene keratinase, sau đó sản phẩm được tiến hành tinh sạch và kiểm tra lại trên gel 0, 8% (Hình 3.11).
Chuyên ngành Di truyền học 58 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.11: Sản phẩm tinh sạch Ker và vertor pET 32a sau khi xử lý bằng 2 enzyme cắt.M: marker;1: Ker chủng Đ.NĐ.1.2; 2: Ker chủng L.NĐ.3.4; 3:
Vertor pET 32a.
Theo lý thuyết, vector pET 32a được chọn làm hệ vertor biểu hiện vì vector pET 32a có promoter lai T7/lac, vị trí đa nhân dòng (multi cloning site), và trình tự kết thúc T7. Việc phiên mã từ promoter lai T7/lac đòi hỏi phải có T7 RNA polymerase. Tế bào E. coli chủ có gene mã hóa cho T7 RNA polymerase được đưa vào nhiễm sắc thể bằng công nghệ gene, nhưng protein kìm hãm lac operon, lacI, ức chế biểu hiện gene này. Khi IPTG được thêm
vào, nó cảm ứng việc giải phóng lacI ra khỏi operator của lac operon và quá trình phiên mã được bắt đầu. T7 RNA polymerase sau đó được tạo ra và bám vào promoter lai T7/lac, và protein tái tổ hợp được sản xuất (Hình 3.12).
Hình 3.12: Vertor tái tổ hợp pET 32a/Keratin 3.10.3. Biến nạp sản phẩm lai vào tế bào khả biến DH10B
Lai đoạn gene keratinase sau khi xử lý bằng 2 enzyme cắt BamH I; Xho I vào vertor pET 32a rồi biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH10B [32]. Kết quả sau biến nạp, các khuẩn lạc đã mọc được trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh Ampicillin. Các khuẩn lạc này sẽ chọn lọc để tách plasmid (Hình 3.13).
Chuyên ngành Di truyền học 59 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.13: Sản phẩm biến nạp của 2 chủng vi khuẩn vào tế bào khả biến E.coli DH10B
3.10.4. Tách DNA plasmid tái tổ hợp
DNA plasmid tái tổ hợp được tách chiết với bộ hóa chất QIAprep Spin Plasmid Extraction Kit (QAGEN Inc). Vì số lượng khuẩn lạc mọc rất nhiều nên chúng tôi tiến hành chọn ngẫu nhiên mỗi đĩa 8 khuẩn lạc trắng để kiểm tra sản phẩm sau biến nạp, sau đó điện di trên gel agarose 0.8%. Kết quả được trình bày trên hình 3.14.
Chuyên ngành Di truyền học 60 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.14: Ảnh điện di sản phẩm tách DNAplasmid tái tổ hợp 1- 8: Chủng L.NĐ.3.4
9-16: Chủng Đ.NĐ. 1.2 17: Đối chứng
Quan sát phổ điện di thấy rằng, DNA plasmid của các chủng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp sẽ có kích thước lớn hơn so với DNA plasmid của chủng đối chứng (do chủng DH10B chỉ mang vector pET 32a, không mang gen Ker). Vì vậy, các DNA plasmid có kích thước lớn hơn so plasmid đối chứng sẽ được chọn và kiểm tra lại bằng phản ứng cắt enzyme.
Sản phẩm cắt DNA plasmid được kiểm ta lại bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%. Kết quả điện di thể hiện ở hình 3.15, sản phẩm cắt plasmid xuất hiện 2 băng có kích thước hoàn toàn phù hợp với kích thước của vector pET 32a (khoảng 5.9 kb) và đoạn gen Ker (khoảng 1.2 kb). Kết quả này cho thấy, đoạn gene Ker đã được đưa vào vector pET 32a thành công. Plasmid tái tổ hợp mang gene Ker sẽ được đưa vào biểu hiện ở vi khuẩn E.coli BL21.
Chuyên ngành Di truyền học 61 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.15 Sản phẩm phản ứng cắt DNA plasmid TTH bằng 2 enzyme
XhoI và BamHI
3.11. Đánh giá hoạt tính ezyme dịch thô của chủng chọn lọc
3.11.1. Định lƣợng Protein bằng phƣơng pháp Bradford
Xây dựng đƣờng chuẩn protein
Phương pháp Bradford là một phương pháp xác định nồng độ protein rất nhanh, chính xác và được sử dụng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu protein. Phương pháp Bradford dựa trên sự liên kết của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue G-250 với Protein. Hai loại protein sử dụng là albumin huyết thanh bò (BSA- Bovine serum albumin) và gamma- globulin. Với phương pháp Bradford, mầu thuốc nhuộm phát triển rõ ràng với BSA hơn so với loại protein khác, nên BSA là loại prtein chuẩn được sử dụng phổ biến. Sau khi tiến hành thí nghiệm đã xây dựng đường chuẩn bằng cách đo OD tại bước sóng 595nm của BSA chuẩn ở các nồng độ khác nhau (trình bày ở phần phương pháp 2.2.9). Kết quả thể hiện ở bảng 3.8 và hình 3.16.
Bảng 3.8: Kết quả đo giá trị mật độ quang (OD) của BSA
Chuyên ngành Di truyền học 62 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Y (Giá trị OD/595nm) 0 0,025 0,079 0,125 0,161 0,217
Hình 3.16: Đƣờng chuẩn Bradford
Với phương pháp trên, BSA ở nồng độ 0,1 mg/ml pha loãng với nước thành các nồng độ khác nhau (bảng 3.8), thì giá trị OD595 tăng dần theo nồng độ của BSA. Do đó, ta xây dựng được đường chuẩn protein có dạng y= ax + b với trục tung là giá trị OD và trục hoành là nồng độ của BSA (hình 3.16). Vậy với thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue G-250 phát triển rõ ràng với BSA, đủ điều kiện để tiến xác định hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu.
Xác định hàm lƣợng protein trong mẫu nghiên cứu
Dựa vào đường chuẩn BSA đã xây dựng được ở trên, chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng protein trong dịch nổi của 2 chủng chọn lọc theo phương pháp Bradford với tỷ lệ phản ứng đã nêu phần phương pháp (2.2.9). Kết quả đo khả năng hấp thụ ánh sáng (OD) tại bước sóng 595 nm và hàm lượng protein của 2 chủng chọn lọc được thể hiện ở bảng 3.9. Hàm lượng protein tổng số ở chủng L.NĐ.3.4 là 0.220 mg/ml, trong khi đó hàm lượng protein ở chủng Đ.NĐ.1.2 có hàm lượng protein tổng số là 0.238 mg/ml. Những kết
Chuyên ngành Di truyền học 63 Lớp Sinh K17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
SDS PAGE biến tính. Ngoài ra, sẽ giúp cho các nghiên cứu tiếp theo về tinh sạch sản phẩm keratianse.
Bảng 3.9: Kết quả đo mật độ quang (OD) và hàm lƣợng protein của dịch nổi vi khuẩn
Mẫu Giá trị OD595 Hàm lƣợng protein (mg/ml)
L.NĐ.3.4 0,379 0,220
Đ.NĐ.1.2 0,409 0,238
3.11.2. Thử hoạt tính enzyme bằng azokeratin
Xác định hoạt tính keratinase bằng azokeratin là một phương pháp phổ biến và có độ tin cậy cao khi nó có thể xác định chính xác đơn vị hoạt tính keratinase. Sau khi tiến hành phản ứng, dung dịch phản ứng được đo quang phổ ở bước sóng 440nm (Thí nghiệm được lặp lại 3 lần). Kết quả cho thấy dịch thủy phân đối với 2 chủng L.NĐ. 3.4 và Đ.NĐ.1.2 lần lượt là 12,1U và
12,7U (bảng 3.10).