5. THỜI GIAN
2.3.PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
- Phƣơng pháp thu thập số liệu, điều tra hiện trạng, lấy mẫu ngẫu nhiên, khách quan, trung thực.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
* Lấy mẫu máu:
Trƣớc khi lấy máu cần cố định lợn chắc chắn. Lợn con thì bắt giữ, còn lợn lớn lấy dây móc vào răng nanh hàm trên của lợn kéo lên sao cho đầu lợn ngửa về phía sau để cố định.
Vị trí lấy máu: Vịnh tĩnh mạch cổ của lợn, sát trùng vị trí lấy máu bằng cồn 700
hoặc cồn iod trƣớc khi lấy máu. Dùng xy lanh loại 10ml và kim lấy máy vô trùng đâm vào vịnh tĩnh mạch cổ lợn, khi thấy máu chảy ra đốc kim thì hút lƣợng máu 3 – 5 ml rồi bơm ngay vào ống nghiệm, lắc nhẹ và để ống nghiệm nghiêng 450, chắt huyết thanh.
Mẫu đƣợc bảo quản trong bình lạnh và gửi về Trung tâm chẩn đoán thú y Trung ƣơng để xét nghiệm bằng phƣơng pháp RT-PCT.
Tỷ lệ mẫu(+) tính (%) = x 100
Phƣơng pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
- Phản ứng ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) phƣơng pháp miễn dịch gắn men phát hiện kháng thể sau khi vius xâm nhập 3 tuần, thuận lợi của phƣơng pháp này là có thể chẩn đoán một số lƣợng lớn huyết thanh và các kết quả thu đƣợc của các phòng thí nghiệm là tƣơng đối đồng nhất. Một ƣu điểm nữa của phƣơng pháp này là có thể phát hiện đƣợc cả vius chủng Bắc Mỹ và chủng Châu Âu.
* Các bƣớc tiến thành ELISA
Bước 1: Pha loãng kháng thể 1 kháng virus PRRS trong đệm gắn bản
(coating) để có nồng độ 2 /ml. Đổ 50 /ml kháng thể đã pha loãng này vào mỗi giếng của tấm nhựa ELISA và để qua đêm ở nhiệt độ 40
C.
Bước 2: Rửa 3 lần với đệm tẩy rửa:
Số mẫu (+) tính Số mẫu xét nghiệm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Che chắn phần không có gắn kháng thể bằng 150 l dung dịch pha loãng trong 1-2 giờ ở nhiệt độ phòng.
Bước 3: Pha loãng các mẫu và bổ sung 50 l vào các giếng làm một mẫu
đối chứng dƣơng và một mẫu đối chứng âm, ủ 370C trong một giờ.
Bước 4: Rửa 3 lần với đệm tẩy rửa
Bước 5: Bổ sung kháng thể 2 kháng virus PRRS đã pha loãng, ủ ở nhiệt
độ phòng 1 giờ.
Bước 6: Rửa 3 lần với đệm tẩy rửa
Bước 7: Bổ sung cộng hợp kháng thể 2 có gắn enzyme đã pha loãng, ủ ở
nhiệt độ phòng 1 giờ.
Bước 8: Rửa 3 lần với đệm tẩy rửa
Bước 9: Bổ sung dung dịch cơ chất và ủ ở nhiệt độ phòng cho hiện màu
trong khoảng 10-30 phút. Dừng phản ứng và đọc kết quả bằng máy đọc ELISA.
Bước 10: Các mẫu đối chứng: đối chứng dƣơng tính, đối chứng âm tính,
đối chứng cộng hợp và đối chứng cơ chất phải đƣợc tiến hành đồng thời. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Phƣơng pháp xác định nguy cơ bệnh
* So sánh tần suất bệnh theo công thức của Michael thrusfield (1986):
2 TN = Trong đó: 2 TN : Tần suất bệnh N: Tổng số mẫu xét nghiệm
a : Số mẫu huyết thanh của lợn nái dƣơng tính b : số mẫu huyết thanh của lợn nái âm tính
c : số mẫu huyết thanh của lợn thịt (sữa) dƣơng tính n. ( a.d – b.c – n/2)2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
d : số mẫu huyết thanh của lợn thịt (sữa) âm tính a+b: Tổng số mẫu huyết thanh lợn nái xét nghiệm
c+d: Tổng số mẫu huyết thanh lợn thịt (sữa) xét nghiệm a+c: Tổng số mẫu dƣơng tính
b+d: Tổng số mẫu âm tính - Tìm các giá trị 2 ứng với độ tự do = (l1-l)(l2-l) bằng cách tra bảng phân bố 2 - So sánh 2 TN và 2 : Nếu 2
TN < 20,05 thì kết luận không có sự sai khác giữa 2 tỷ lệ Nếu 2
TN > 2
0,05 thì kết luận có sự sai khác nhau giữa 2 tỷ lệ với độ tin cậy 95%.
Nếu 2
TN ≥ 2
0,01 thì kết luận có sự sai khác khá rõ rệt giữa 2 tỷ lệ với độ tin cậy 99%.
Nếu 2
TN ≥ 2
0,001 thì kết luận có sự sai khác rất rõ rệt giữa 2 tỷ lệ với độ tin cậy 99,9%.
* Xác định nguy cơ tƣơng đối giữa các loại lợn theo Nguyễn Nhƣ Thanh (2007) [19] Rr = = Trong đó: Ie: tỷ lệ mắc bệnh ở nhóm lợn nái Io: tỷ lệ mắc bệnh ở nhóm lợn thịt (sữa) a: Số lợn nái mắc bệnh b: Số lợn nái không mắc bệnh c: Số lợn thịt (sữa) mắc bệnh d: Số lợn thịt (sữa) không mắc bệnh a+b: tổng số lợn nái Ie Io a/(a+b) c/(c+d)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
c+d: tổng số lợn thịt (sữa)
- Nếu RR = 1 tức tỷ lệ mắc bệnh ở cả 2 nhóm nhƣ nhau.
- Nếu RR>1 tức nguy cơ mắc bệnh của nhóm lợn nái cao hơn nhóm lợn thịt (sữa) gấp RR lần
- Nếu RR < 1 tức nguy cơ mắc bệnh của nhóm lợn nái thấp hơn nhóm lợn thịt (sữa).