Chất I và chất II được gửi đo và giải phổ NMR (phổ H, phổ C, DEPT, HSQC, COSY, HMBC) và khối phổ MS.
Dựa vào kết quả phổ NMR một chiều và 2 chiều, dựđoán cấu trúc của chất I là vitexin và chất II là isoquercitrin.
Phổ H và phổ C của chất I và chất II được đối chiếu với phổ của chất chuẩn
73
Bảng 3.21:Thông số phổ 1H (500 MHz, DMSO) và 13C-NMR (125 MHz, DMSO) của chất I đối chiếu với vitexin [52]
Chất I Vitexin C 13C 1H 1H 13C δ(ppm) δ(ppm) δ(ppm) δ(ppm) 2 163,85 164,98 3 102,37 6,77 6,94 (1H, s, H-3) 102,51 4 181,97 182,73 5 155,90 13,16 13,17 (1H, s, 5-OH) 155,64 6 98,08 6,44 (1H, s, H-6) 98,45 7 162,49 10,83(1H, s, 7-OH) 162,31 8 104,55 104,56 9 160,32 160,28 10 103,96 104,07 1’ 121,54 122,07 2’ 128,81 8,03 8,26 (2H, d, J = 8,7 Hz, H-2’) 128,99 3’ 115,73 6,90 7,05 (2H, d, J= 8,7 Hz, H-3’) 115,01 4’ 161,03 10,35 (1H, s, 4’-OH) 161,32 5’ 115,73 6,88 7,05 (2H, d, J= 8,7 Hz, H-5’) 115,01 6’ 128.81 8,01 8,26 (2H, d, J = 8,7 Hz, H-6’) 128,99 1” 73,31 4,93 4,94 (1H,d, J = 9,8 Hz, H-1’’) 73,93 2” 70,82 71,03 3” 78,62 79,01 4” 70,54 70,20 5” 81,71 81,29 6” 61,26 61,36
74 Bảng 3.22:Kết quả phổ1H (500 MHz, DMSO) và 13C-NMR (125 MHz, DMSO) của chất II đối chiếu với isoquercitrin [21] Chất II isoquercitrin C 13C 1H 1H 13C δ(ppm) δ(ppm) δ(ppm) δ(ppm) 2 156,16 156,0 3 133,35 133,2 4 177,39 177,2 5 161,18 161,0 6 98,58 6,20 6,18 (1H, d, J = 1,8 Hz, H-6) 98,6 7 164,03 164,0 8 93,42 6,40 6,39 (1H, d, J = 1,8 Hz, H-8) 93,5 9 156,27 156,1 10 103,95 103,9 1’ 121,15 121,0 2’ 115,15 7,56 7,56 (1H, br s, H-2′) 115,1 3’ 144,72 144,6 4’ 148,37 148,3 5’ 116,19 6,83 6,83 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-5′) 116,1 6’ 121,51 7,58 7,58 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-6′) 121,5 1” 100,96 5,45 5,45 (1H, d, J = 6,9 Hz, H-1″) 100,8 2” 74,06 74,1 3” 76,49 76,5 4” 69,94 70,0 5” 77,42 77,5 6” 60,97 61,0
Kết quả đối chiếu phổ NMR chất I và chất II với 2 chất dự đoán đã được công bố phổ NMR như trên, ta thấy chất I đúng là vitexin (C21H20O10 : (1S)-1,5-anhydro- 1-[5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4-oxo-4H-chromen-8-yl]-D-glucitol) và
75
chất II là isoquercitrin (C21H20O12: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy-4-oxo- 4H-chromen-3-yl β-D-glucopyranosid), công thức cấu tạo được thể hiện ở hình 3.22
Cấu trúc của chất I - vitexin Cấu trúc của chất II - isoquercitrin
Hình 3.22: Công thức cấu tạo của chất I và chất II
Cả 2 hợp chất phân lập được đều đã từng được những nghiên cứu trước đây công bố có trong lá cây Chùm Ngây [44, 46], và đều có hoạt tính chống oxy hóa [34].
Ngoài ra, vitexin (chất I) còn được tìm thấy trong nhiều loài thuộc chi Passiflora như là P. edulis, P. alata, P. tripartita, P. quadrangularis và P. manicata
[54]. Vitexin cũng có trong nhiều loài cây khác như vỏ hạt Đậu Xanh (Phaseslus aureus), quả Bồ Kết (Gleditschia autralis), Trollius ledebouri (1 loài thuôc họ
Ranunculaceae)… [52] Ngoài hoạt tính chống oxy hóa, vitexin còn được biết đến với nhiều hoạt tính sinh học khác như: chống ung thư [53], chống nguyên sinh động vật [37], kháng viêm theo cơ chế kháng histamine [49]… Tại Việt Nam, vitexin cũng đã từng được phòng khám đa khoa Đại học Y - Dược phân lập và sản xuất thành chế phẩm với tên biệt dược là Vitex, có công dụng chữa viêm gan B, C.
Đồng thời, isoquercitrin (chất II) cũng đã được phát hiện trong lá Chùm Ngây từ rất sớm, xem như một trong những flavonoid chủ yếu của lá Chùm Ngây. Isoquercitrin cũng chiếm tỉ lệ khá cao trong thành phần hóa học của nhiều loài cây
76
quen thuộc như lá Hồng Sen (Nelumbo lucifera) – chiếm 5,75%, lá Nho Đen Hy Lạp (Ribes nigrum) – chiếm 5,5%, hay lá giấp cá (Houttuynia cordata), quả nho Concord (Vitis labrusca), lá các loài É Lá Chụm (Hyptis fasciculata), quả Việt Quất (Vaccinium myrtillus), lá cây Đỗ Trọng (Eucommia ulmoides),cây Trắc Bá (Thuja orientalis)… [12, 22, 31, 34, 51] Hoạt tính chống oxy hóa của isoquercitrin rất mạnh, được khảo sát là có tác dụng oxy hóa mạnh nhất trong cây Trắc Bá [34]. Ngoài ra, isoquercitrin còn những hoạt tính sinh học nổi trội như là: ức chế thành lập AGEs (Advanced Glycation End-products), là tác nhân quan trọng trong bệnh
đái tháo đường; làm giảm sự tăng sinh tế bào glioblastoma và làm thay đổi sự nhận biết của thụ quan beta-catenin của tế bào… [12, 21, 35]
Kết quả xác định 2 hợp chất chống oxy hóa trên từ lá cây Chùm Ngây là một bằng chứng khoa học về khả năng chống oxy hóa của lá Chùm Ngây và cũng là một cơ sở dữ liệu cụ thể làm tiền đề cho những nghiên cứu về các hoạt tính khác có liên quan của lá Chùm Ngây như chống ung thư, chữa tiểu đường, kháng viêm…
3.6 Tái đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất phân lập được
3.6.1. Hoạt tính quét gốc tự do DPPH
2 hợp chất phân lập được từ phân đoạn etyl acetat của Chùm Ngây được tiến hành tái đánh giá hoạt tính quét gốc tự do DPPH theo mục 2.2.6.1. Kết quả khảo sát được trên khoảng tuyến tính giữa nồng độ chất thử và khả năng quét gốc tự do DPPH được thể hiện trong bảng 3.23, 3.24 và hình 3.22 và 3.24.
Bảng 3.23: Thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH trên vitexin Vitexin Ống Nồng độ (μg/ml) OD trung bình HTCO (%) Mẫu Phản ứng Chứng 0 0 0,871 1 100 25 0,658 24,455 2 200 50 0,547 37,199
77 3 400 100 0,355 59,242 4 800 200 0,068 92,193 5 1000 250 0,060 93,111 Hình 3.23: Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của vitexin
Bảng 3.24: Thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH trên isoquercitrin Isoquercitrin Ống Nồng độ (μg/ml) OD trung bình HTCO (%) Mẫu Phản ứng Chứng 0 0 0,859 1 10 2,5 0,725 15,600 2 15 3,75 0,615 28,405 3 20 5 0,550 35,972 4 25 6,25 0,478 44,354 5 30 7,5 0,345 59,837 6 35 8,75 0,268 68,801 7 40 10 0,215 74,971
78
Hình 3.24: Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của Isoquercitrin.
Từ giá trị khảo sát được trong khoảng tuyến tính như trên của 2 chất, ta tính
được IC50 về khả năng quét gốc tự do DPPH của 2 chất, đối chiếu với kết quả IC50
của cao phân đoạn etyl acetat và vitamin C, kết quả thể hiện như bảng 3.25 và hình 3.25.
Bảng 3.25: Giá trị IC50 về khả năng quét gốc tự do của vitexin và isoquercitrin
Mẫu Giá trị IC50
(μg/ml)
Vitexin (Chất I) 85,18 Isoquercitrin (Chất II) 6,64
Cao etyl acetat 24,59
79
Hình 3.25: Giá trị IC50 về hoạt tính quét gốc tự do DPPH của vitexin và isoquercitrin so với Vitamin C.
Trong phản ứng của chất chống oxy hóa với DPPH, gốc tự do bền DPPH có màu tím sẽđược chuyển đổi thành α-α-diphenyl-β-picryl hydrazin không màu. Chất chống oxy hóa sẽ chuyển một H+ cho DPPH, do đó trung hòa được gốc tự do này.
Kết quả khảo sát các phân đoạn cao cho thấy, cao etyl acetat có hoạt tính quét gốc tự do cao nhất, với IC 50 là 24,59 μg/ml vì đây là phân đoạn tập trung nhiều hợp chất phenolic nhất.
Khảo sát 2 hợp chất phân lập được từ phân đoạn này là vitexin và isoquercitrin nhận nhấy:
- Cả hai chất vitexin và isoquercitrin đều thể hiện hoạt tính quét gốc tự do DPPH.
- Vitexin có IC50 là 85,18 μg/ml, và isoquercitrin có IC50 là 6,64μg/ml. Isoquercitrin có hoạt tính quét gốc tự do DPPH mạnh hơn rất nhiều so với vitexin. Điều đó thể hiện khả năng nhường H+ của isoquercitrin cao hơn vitexin. So sánh về mặt cấu tạo, isoquercitrin có nhiều nhóm OH hoạt động
80
hơn vitexin. Chính những nhóm OH hoạt động này quyết định hoạt tính quét gốc tự do của chúng.
- Isoquercitrin cũng thể hiện hoạt tính quét gốc tự do DPPH mạnh hơn cao phân đoạn etyl acetat. Kết quả SKLM cho thấy vết của isoquercitrin to và
đậm, thể hiện chúng chiếm một tỉ lệ khá cao trong phân đoạn này. Mặt khác, giá trị IC50 về khả năng quét gốc tự do DPPH của isoquercitrin thấp hơn cao phân đoạn etyl acetat gần 4 lần. Như vậy có thể kết luận isoquercitrin đóng vai trò chủđạo, quyết định hoạt tính chống oxy hóa của phân đoạn etyl acetat từ lá Chùm Ngây. Vitexin lại có IC50 cao hơn phân đoạn etyl acetat, thể hiện hoạt tính thấp hơn, góp một phần vai trò trong hướng đáp ứng chống oxy hóa của phân đoạn.
- Isoquercitrin cũng thể hiện hoạt tính quét gốc tự do DPPH xấp xỉ với vitamin C (IC50=7,41μg/ml), thậm chí còn có phần nổi trội hơn. Kết quả này cho thấy tiềm năng khai thác isoquercitrin từ lá Chùm Ngây phát triển thành thuốc chống oxy hóa tương tự như vitamin C.
3.6.2. Khảo sát năng lực khử
2 chất phân lập được cũng đồng thời được tiến hành thẩm định khả năng chống oxy hóa bằng khảo sát năng lực khử.
Siddhuraju đã công bố năng lực khử của một phức hợp nào đó có liên quan
đến hoạt tính chống oxy hóa của phức hợp đó [48]. Năng lực khử của một chất là khả năng nhường điện tử của chất đó khi tham gia phản ứng phả oxy hóa – khử. Do
đó, năng lực khử thường được sử dụng như một chỉ thị để đánh giá hoạt động chuyển electron từ chất có khả năng chống oxy hóa cho các tác nhân oxy hóa, đưa chúng về trạng thái cân bằng. Đánh giá năng lực khử cho phép sơ bộđánh giá được tiềm năng chống oxy hóa của một chất.
Tiến hành thí nghiệm như đã trình bày ở mục 2.2.6.2. Kết quả thu được như
81 Bảng 3.26: Năng lực khử của vitexin và isoquercitrin Mẫu Năng lực khử (ΔOD) 200 μg/ml 400 μg/ml 600 μg/ml 800 μg/ml 1000 μg/ml Vitexin 0,192 0,418 0,443 0,472 0,512 Isoquercitrin 0,293 0,630 0,983 1,262 1,636 Vitamin C 0,462 0,952 1,398 1,986 2,308
Hình 3.26: Năng lực khử của vitexin, isoquercitrin và Vitamin C.
Phân tích kết quả thu được cho thấy:
- Vitexin, isoquercitrin và vitamin C đều có năng lực khử tăng khi tăng nồng
độ chất thử nghiệm.
- Năng lực khử của isoquercitrin luôn cao hơn vitexin tại các nồng độ như
nhau trong khoảng giá trị khảo sát. Đồng thời, khi nồng độ càng tăng thì khoảng chênh lệch giữa năng lực khử của isoquercitrin so với vitexin càng tăng. Có thể kết luận năng lực khử của isoquercitrin cao hơn vitexin. Cả 2 chất đều là những chất nhường điện tử tốt và có thể làm ngừng chuỗi phản
82
ứng của các gốc tự do bằng cách biến đổi các gốc tự do thành những sản phẩm bền.
- So với chứng dương, năng lực khử của vitexin và isoquercitrin đều thấp hơn vitamin C. Ở nồng độ 1000 μg/ml, năng lực khử của vitexin chỉ bằng 22,18% và của isoquercitrin bằng 70,71% so với vitamin C. So sánh với kết quả khảo sát hoạt tính quét gốc tự do DPPH, vitamin C có năng lực khử cao hơn nhưng lại có hoạt tính quét gốc tự do DPPH thấp hơn so với isoquercitrin. Năng lực khử được khảo sát dựa trên khả năng nhường electron và hoạt tính quét gốc tự do DPPH dựa trên khả năng cho H+. Như
vậy isoquercitrin là hợp chất có khả năng nhường H+ tốt hơn vitamin C, nhưng khả năng nhường electron thấp hơn vitamin C. Hoạt tính quét gốc tự
do DPPH và năng lực khử của một chất đều phụ thuộc vào số gốc OH tự do mang H linh động và khả năng phân cực của liên kết O-H trong cấu trúc phân tử của chất thử nghiệm.
3.6.3 Khảo sát hoạt tính quét gốc hydroxyl tự do
Bên cạnh năng lực khử, 2 chất thử nghiệm cũng được khảo sát khả năng quét gốc tự do theo một cơ chế khác, cơ chế quét gốc hydroxyl tự do.
Hydroxyl tự do (OH.) là gốc tự do có tính oxy hóa rất mạnh nhờ mang 1 điện tử tự do có điện thế khử lên đến 2310 mV nên có khả năng tác động lên các cơ thể
sống một cách nhanh chóng, mà cụ thể là tác động lên lipid, polypeptide, protein và DNA, đặc biệt là thiamine và guanosine (Kiara, 2004). Hydroxyl tự do cũng là gốc tự do khá phổ biến trong các cơ thể sống, được sinh ra trong các phản ứng hóa sinh của cơ thể trong suốt chu trình sống. Chất có khả năng kháng gốc hydroxyl tự do, nghĩa là có khả năng phân hủy các gốc hydroxyl tự do sinh ra từ phản ứng trên,
được xem như có khả năng chống oxy hóa.
Kết quả thu được về khả năng kháng gốc hydroxyl tự do của vitexin và isoquercitrin được đối chiếu với vitamin C như bảng 3.27 và hình 3.27.
83
Bảng 3.27: Hoạt tính quét gốc hydroxyl tự do của vitexin và isoquercitrin.
Mẫu Khả năng kháng hydroxyl tự do (%) 200 µg/ml 400 µg/ml 600 µg/ml 800 µg/ml 1000 µg/ml Vitexin (chất I) 47,649 55,016 60,502 65,204 70,141 Isoquercitrin (chất II) 46,730 49,961 53,349 57,526 60,441 Vitamin C 2,536 6,809 11,085 17,260 21,378
Hình 3.27: Hoạt tính quét gốc hydroxyl tự do của vitexin và isoquercitrin.
Từ giá trị khảo sát trên, ta có thể tính được giá trị IC50 tương đối về khả năng quét gốc hydroxyl tự do của chất I và chất II như bảng 3.28 và hình 3.28.
84
Bảng 3.28: Giá trị IC50 về khả năng quét gốc hydroxyl tự do của vitexin và isoquercitrin Mẫu Giá trị IC 50 (μg/ml) Vitexin (Chất I) 248,152 Isoquercitrin (Chất II) 394 Vitamin C 2183
Hình 3.28: Giá trị IC50 về khả năng quét gốc hydroxyl tự do
Kết quả khảo sát được cho thấy khả năng quét gốc hydroxyl tự do của cả
vitexin và isoquercitrin đều mạnh hơn rất nhiều so với vitamin C (IC50 lần lượt là 248,152µg/ml, 394µg/ml và 2183µg/ml).
Vitexin có khả năng quét gốc tự do DPPH và năng lực khửđều thấp hơn so với isoquercitrin, nhưng hoạt tính quét gốc hydroxyl tự do cao hơn isoquercitrin.
Điều này chứng tỏ khả năng quét gốc hydroxyl tự do của một chất chống oxy hóa
85
Những khảo sát tái đánh giá hoạt tính chống oxy hóa cho thấy cả 2 chất phân lập được từ phân đoạn ethyl acetat của lá Chùm Ngây đều có khả năng chống oxy hóa theo nhưng cơ chế khác nhau, và đều có tiềm năng phát triển thành thuốc hay thực phẩm chức năng có công dụng chống oxy hóa.
86
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ
4.1. Kết luận
4.1.1. Xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu
Xác định giảm khối lượng do sấy khô là 78,13 %. Độ ẩm bột dược liệu là 8,857 %. Độ tro toàn phần là 13,297 %. Tro không tan trong HCl là 0,363 %.
Xác định sơ bộ thành phần hóa thực vật, trong là Chùm Ngây có các hợp chất tinh dầu, acid béo, carotenoid, triterpenoid, alkaloid, anthraquinon, coumarin, tanin, flavonoid, saponin, chất khử, acid hữu cơ và polyuronic.
4.1.2. Quy trình chiết xuất dược liệu và thu cao phân đoạn
Đã thiết lập quy trình chiết cao cồn tổng lá Chùm Ngây, từ 10 kg nguyên liệu lá tươi thu được 600 g cao tổng. Bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng, thu được 4 cao phân đoạn: Cao eter 168 g, cao cloroform 2,63 g, cao etyl acetat 28,40g, cao nước 120 g.
4.1.3. Định lượng phenolic tổng và khảo sát hoạt tính chống oxi hóa của các phân đoạn phân đoạn
¾ Định lượng phenolic tổng:
- Hàm lượng phenolic tổng trong cao cồn tổng là 108,011μg GAE/mg.
- Hàm lượng phenolic tổng trong cao eter, cao cloroform, cao etyl acetat và cao nước lần lượt là 44,528 μg GAE/mg, 110,914 μg GAE/mg, 271,822 μg GAE/mg, 90,881μg GAE/mg. Hàm lượng phenolic tổng tập trung nhiều nhất trong phân đoạn etyl acetat.
¾ Khảo sát hoạt tính chống oxi hóa thông qua cơ chế quét gốc tự do DPPH:
Giá trị IC50 về khả năng quét gốc tự do DPPH của cao cồn tổng, cao eter, cao cloroform, cao etyl acetat và cao nước lần lượt là 95,26 μg/ml, 287,79 μg/ml, 148,35 μg/ml, 24,59 μg/ml và 206,69 μg/ml. Kết quả cho thấy phân đoạn etyl acetat là phân đoạn có hoạt tính chống oxi hóa cao nhất.
4.1.4. Phân lập các hợp chất có hoạt tính chống oxi hóa
Từ phân đoạn etyl acetat, tiến hành phân lập được 2 hợp chất có hoạt tính chống oxi hóa là vitexin (25 mg) và isoquercitrin (200 mg).
87
Chùm Ngây là đối tượng đang được quan tâm nghiên cứu nhiều trên thế giới cũng như trong nước. Tuy nhiên đây là nghiên cứu đầu tiên trong nước được công bố đã phân lập được chính xác 2 trong số các hợp chất có hoạt tính chống oxi hóa trong lá Chùm Ngây.
4.1.5. Tái đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của các chất phân lập
¾ Hoạt tính quét gốc tự do DPPH:
Giá trị IC50 của vitexin và isoquercitrin là 85,18 μg/ml và 6,64 μg/ml. Isoquercitrin có hoạt tính cao hơn vitexin và cao hơn chứng dương vitamin C.
¾ Khảo sát năng lực khử:
Ở nồng độ 1000 μg/ml, vitexin đạt được 21,66 % năng lực khử của vitamin