2.2.3.1. Định tính bằng phương pháp hóa học cao phân đoạn
Các phân đoạn cao Eter, cao Cloroform, cao Etyl acetat, cao nước được đem phân tích định tính sự hiện diện của các nhóm chất chính đã cho kết quả dương tính trong phần khảo sát sơ bộ hóa thực vật.
27
Hòa mỗi cao phân đoạn trong 4 ml dung dịch acid hydrocloric1%. Chia dung dịch acid vào 4 ống nghiệm nhỏ. Định tính alkaloid bằng các thuốc thử Mayer, Bouchardat, Dragendorff [3].
Hình 2.1: Quy trình chiết xuất cao phân đoạn từ lá Chùm ngây tươi.
- Thuốc thử Mayer: tủa trắng – vàng nhạt
- Thuốc thử Bouchardat: tủa đỏ nâu
- Thuốc thử Dragendorff: tủa đỏ cam
Lắc phân đoạn Chiết cồn 96% Tỉ lệ 6 : 1 Dịch lắc eter Lá Chùm ngây tươi 10 kg Bã dược liệu Dịch cồn Cao cồn tổng Cô giảm áp Dịch lắc
cloroform etyl acetat Dịch lắc
Dịch nước còn lại
Cô giảm áp Cô giảm áp Cô giảm áp Cô giảm áp
28
So sánh kết quả với ống chứng không có thuốc thử. Nếu dung dịch đục hơn so với ống chứng hoặc có tủa: có alkaloid.
• Xác định nhóm Flavonoid:
¾ Tác dụng với H2SO4đậm đặc:
Hòa tan mỗi cao phân đoạn vào H2SO4 đậm đặc: flavon và flavonol cho màu vàng đậm đến vàng cam và có phát huỳnh quang đặc biệt. Chalcon, auron cho màu đỏ hoặc xanh dương – đỏ. Flavanon cho màu từ cam đến đỏ.
¾ Tác dụng với dung dịch NaOH 1% / etanol:
Nhỏ dung dịch NaOH vào một dung dịch có cao đã hòa tan trong etanol, sẽ có màu từ vàng đến cam - đỏ. Nếu là flavon, isoflavon, chalcon, leucoantocyanidin sẽ có màu vàng. Flavonol cho màu từ vàng đến cam. Auron cho màu đỏđến đỏ tím.
¾ Phản ứng cyanidin của Wilstatter:
Chuẩn bị 2 ống nghiệm, cho vào mỗi ống 2 ml cao chiết hòa tan trong methanol. Ống 1 làm đối chứng. Với ống số 2: cho thêm 1 ml alcol tert – butyl, 0.5ml HCl đậm đặc, 3-5 hạt magnesium kim loại. Đun nhẹ trong vài phút , sẽ xuất hiện màu ở lớp alcol phía trên.
Nếu cao chiết có chứa flavon, flavanon, flavonol, flavanonol, xanthon dung dịch trong ống 2 sẽ có màu cam, đỏ hoặc tím. Nếu cao chiết có chứa isoflavon, isoflavanon, auron dung dịch không đổi màu.
¾ Tác dụng với FeCl3:
Phản ứng cho màu từ xanh lục đến xanh đen • Xác định nhóm polyphenol:
¾ Anthraquinon:
Phản ứng Liebermann: Hòa cao vào dung dịch NaOH 10% lắc đều và pha loãng với nước. Thêm vào một ít bột kẽm và đun sôi dung dịch. Anthraquinon làm dung dịch có màu đỏ. Màu sẽ mất khi lắc dung dịch ngoài không khí và xuất hiện trở lại khi đun nóng.
29
¾ Coumarin:
Hòa cao trong 2ml cồn 70%. Chia đều dịch chiết vào 2 ống nghiệm nhỏ. Thêm vào ống thứ nhất 0.5ml KOH10% và ống thứ hai một lượng nước cất tương đương. Đun cách thủy cả 2 ống nghiệm trong 2 phút, để nguội và soi dưới đèn tử ngoại 365nm. Dung dịch trong ống một phát huỳnh quang mạnh hơn dung dịch trong ống thứ 2 là có coumarin.
¾ Tannin :
Lấy 2ml dịch lọc, thêm vào 5 giọt dung dịch gelatin – muối, khuấy đều, so sánh với ống chứng chỉ chứa dịch lọc và ống chứng chỉ chứa thuốc thử (dung dịch gelatin – muối). Nếu có tủa bông trắng là có tannin.
• Xác định nhóm terpenoid:
¾ Phản ứng Liebermann – Burchard để phát hiện steroid –
triterpenoid:
Anhydrid acetic (1ml), chloroform (1ml), làm lạnh ống nghiệm rồi thêm 1 giọt H2SO4 đđ. Cho mẫu vào ở dạng rắn. Phản ứng dương tính là dung dịch đổi thành màu xanh dương, lục, cam hoặc đỏ, màu này bền không đổi.
¾ Phảnứng Rosenthler để phát hiện steroid – triterpenoid:
Dung dịch mẫu thử (1ml), dung dịch 1% vanilin trong etanol (2 giọt), HCl đậm đặc (1 giọt). Phản ứng dương tính là dung dịch đổi thành màu xanh lục hay tím.
¾ Phảnứng Salkowski để phát hiện steroid:
Hòa tan mẫu thử (1-2mg) trong cloroform (1ml) và nhỏ thêm vào H2SO4 đđ (1ml). Phản ứng dương tính là dung dịch đổi thành màu đỏđậm, xanh, xanh tím.
¾ Phảnứng Carr – Price để phát hiện steroid – triterpenoid:
Dung dịch mẫu thử (1ml), dung dịch 20% SnCl3 trong cloroform (1-2 giọt), nếu có màu đặc trưng, bền , khi so với ống chứng là dương tính.
30
• Xác định hợp chất saponin:
¾ Thửnghiệm tính tạo bọt:
Hòa tan cao vào 5ml nước nóng. Lọc vào một ống nghiệm và để nguội, thêm nước cho đủ 10ml, dùng ngón tay bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh, dứt khoát theo chiều dọc ống nghiệm trong 1 phút. Để yên ống nghiệm, quan sát lớp bọt và đánh giá kết quả.
Đánh giá kết quả:
- Bọt bền trong 15 phút: +
- Bọt bền trong 30 phút: ++
- Bọt bền trong 60 phút:+++
¾ Thử nghiệm Fontan – Kaudel:
Lấy một lượng cao hòa tan với 10ml nước. Chia đều vào 2 ống nghiệm. Ống 1: thêm 2ml HCl 0,5N (pH=1).
Ống 2: thêm 2ml NaOH 0,5N (pH=13).
Lắc trong 1 phút , quan sát và so sánh chiều cao cột bọt giữa 2 ống:
- Nếu cột bọt trong 2 ống tương đương nhau: sơ bộ kết luận dược liệu có saponin triterpen.
- Nếu ống 2 (pH=13) có cột bọt cao hơn ống 1 (pH=1) gấp 2-3 lần: sơ bộ kết luận dược liệu có saponin steroid.
2.2.3.2. Sắc ký lớp mỏng (SKLM) [3], [9] ¾ Chuẩn bị bản mỏng ¾ Chuẩn bị bản mỏng
Sử dụng bản mỏng silicagel – 60 F254, quãng đường di chuyển của dung môi là 8,5 cm.
¾ Chuẩn bị dung dịch mẫu Mẫu được hòa tan trong metanol. ¾ Hệ dung môi khai triển
31
- Hệ 2: Etyl acetat – acid formic – acid acetic – nước (100 : 11 : 11 : 27) ¾ Phát hiện
- Soi đèn UV 254 nm.
- Soi đèn UV 365 nm.
- Thuốc thử FeCl3 5% trong cồn.
2.2.3.3 Phương pháp định lượng phenolic tổng
Hàm lượng phenolic tổng được xác định bằng phương pháp Folin-Ciocalteu theo Waterman và Mole (1994) [18].
¾ Nguyên tắc:
Trong thành phần thuốc thử Folin-Ciocalteu có phức hợp phospho-wolfram- phosphomolybdat. Phức hợp này sẽ bị khử bởi các hợp chất phenolic tạo thành sản phẩm phản ứng có màu xanh dương, hấp thụ cực đại ở bước sóng 758 nm. Hàm lượng phenolic có trong mẫu tỉ lệ thuận với cường độ màu.
¾ Hóa chất:
- Thuốc thử Folin-Ciocalteu.
- Dung dịch Na2CO3 20%.
- Chất chuẩn acid gallic. ¾ Tiến hành thí nghiệm:
- Hút một thể tích xác định mẫu (Chất chuẩn acid gallic hoặc mẫu cần định lượng được pha loãng ở nồng độ thích hợp) cho vào bình định mức 10 ml.
- Thêm 6 ml nước cất vào bình định mức. Lắc đều.
- Cho vào bình 0,5 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu. Lắc đều. Để yên trong 5 phút.
- Thêm vào bình định mức 1,5 ml Na2CO3. Lắc đều.
- Thêm nước vào bình cho vừa đủ 10ml. Lắc đều.
32
9 Dựng đường chuẩn acid gallic Pha dung dịch chuẩn:
Cân 20 mg acid gallic, định mức chính xác đến 10 ml bằng nước cất, được dung dịch có nồng độ 2 mg/ml. Pha loãng tiếp 10 lần được dung dịch có nồng độ 0,2 mg/ml.
Từ dung dịch chuẩn này, hút vào bình định mức những thể tích khác nhau để được giai mẫu có hàm lượng acid gallic là 10 μg, 20 μg, 30 μg, 40 μg, 50 μg.
Tiếp tục tiến hành thí nghiệm như trên.
Bảng 2.1: Quy trình dựng đường chuẩn acid gallic.
Bình định mức 1 2 3 4 5 6
Hút từ dung dịch chuẩn (μl) 0 50 100 150 200 250
Hàm lượng acid gallic (μg) 0 10 20 30 40 50
Nước cất (ml) 6 6 6 6 6 6
Thuốc thửFolin-Ciocalteu (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Lắc đều, để yên 5 phút
Dung dịch Na2CO3 (ml) 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5
Định mức bằng nước cất đế 10ml. Để yên trong tối 2h Đo OD758 nm
9 Định lượng phenolic tổng trong cao cồn tổng và cao phân đoạn
Xác định hàm lượng phenolic tổng trong cao cồn tổng và các cao phân đoạn: cao Eter, cao Cloroform, cao Etyl acetat và cao nước.
Pha nồng độ dung dịch mẫu theo bảng 2.2.
Bảng 2.2: Nồng độ các cao phân đoạn đem định lượng. Mẫu Nồng độ (μg/ml) Hút vào bình định mức (μl) Khối lượng cao định lượng (mg) Cao tổng 2000 200 0,4 Cao Ether 2000 200 0,4
33
Cao Cloroform 2000 200 0,4
Cao Ethyl acetate 2000 50 0,1
Cao nước 2000 200 0,4
Tiếp tục tiến hành thí nghiệm theo các bước nêu trên.
Dựa vào đường chẩn acid gallic để xác định hàm lượng phenolic tổng có trong mẫu. Hàm lượng phenolic tổng được tính bằng đương lượng acid gallic (GAE) có trong 1 mg cao đem định lượng, theo công thức:
P: hàm lượng phenolic tổng (μg GAE/mg). m: khối lượng cao đem định lượng (mg). f(A): phương trình đường chuẩn.
X: độẩm cao (%)
2.2.4 Phân lập các hợp chất chống oxi hóa
2.2.4.1. Xác định các thành phần có hoạt tính chống oxi hóa bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng pháp sắc ký lớp mỏng
Sau khi khảo sát các phân đoạn cao, xác định được phân đoạn có tiềm năng chống oxi hóa cao nhất. Phân đoạn cao được chọn sẽđược khảo sát tiếp để xác định các thành phần có hoạt tính chống oxi hóa bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng.
Mẫu cao được hòa trong metanol. Tải lên bản mỏng sắc ký có chiều dài 10 cm, đường di chuyển cùa dung môi là 8,5 cm.
Hệ dung môi khai triển: Etyl acetat – metanol – nước (100 : 17 : 13)
Sau khi khai trển, bản mỏng được quan sát dưới đèn UV 254 nm và UV 365 nm. Các vết chất được ghi nhận bằng giá trị Rf của chúng.
Phun thuốc thử DPPH 0,05% lên bề mặt của bản mỏng. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
Những thành phần có hoạt tính chống oxi hóa sẽ tạo những vạch màu vàng trên nền tím của bản mỏng, do chất chống oxi hóa làm mất màu tím của thuốc thử
34
DPPH. Dựa vào những vạch này, có thể xác định được những thành phần có hoạt tính chống oxi hóa trong cao phân đoạn.
Chứng dương sử dụng trong thí nghiệm này là vitamin C. So sánh bằng mắt thường độ mất màu của vạch chứng dương và các vạch có hoạt tính khác để xác định mức độ mạnh yếu của hoạt tính.
Những vạch có hoạt tính chống oxi hóa được ghi nhận lại bằng giá trị Rf của chúng.
2.2.4.2. Sắc ký cột nhanh – cột khô
Với những cao chiết từ cây có có nhiều hợp chất khác nhau, ít có phương pháp sắc ký cột hiệu quả chỉ một lần mà tách ra được các đơn chất nên phải thực hiện nhiều lần sắc ký cột. Đối với lượng mẫu cao lớn thì phải tốn nhiều thời gian (nhiều ngày) thực hiện sắc ký cột. Việc gián đoạn để nghỉ có thể làm xáo trộn vị trí sắp xếp của các chất trong quá trình sắc ký. Sắc ký nhanh cột khô được áp dụng để khắc phục những nhược điểm này [5], [9].
Sau khi tiến hành khảo sát phân đoạn có hoạt tính chống oxi hóa cao (phân đoạn etyl acetat), xác định được Rf của các thành phần có hoạt tính chống oxi hóa. Tiến hành sắc ký nhanh – cột khô để bước đầu tách thành những phân đoạn có độ phân cực khác nhau, thành phần đơn giản hơn. Từ những phân đoạn đơn giản này, dễ dàng phân lập tiếp các chất có hoạt tính chống oxi hóa bằng sắc ký cột cố điển một cách hiệu quả hơn.
Cách tiến hành
¾ Chuẩn bị cột sắc ký, dụng cụ:
- Phễu Buchner thành cao đường kính trong 10 cm.
- Bình tam giác.
- Máy hút chân không áp suất 70 mmHg. ¾ Chuẩn bị chất hấp phụ:
- Silicagel hạt vừa 40 – 60 μm.
- Chất hấp phụ được nhồi vào cột theo phương pháp bột khô. Chiều cao lớp hấp phụ: 5 cm.
35
- Nén chặt chất hấp phụ bằng cách gõ cột, kết hợp với áp suất hút ở phía dưới cột và nén cơ học trên định cột. Đặt phía trên bề mặt chất hấp phụ một miếng giấy lọc đểổn định mặt cột.
¾ Nạp mẫu:
- Khối lượng mẫu 20 g.
- Nạp mẫu ở dạng bột khô. Cho hết lượng mẫu khô phủ lên trên đầu cột, vừa khỏ nhẹ thành ngoài của phễu vừa dùng muỗng để trải đều phần bột này để có một lớp mỏng. Đặt lên trên bề mặt cột một miếng giấy lọc để bề mặt không bị xáo trộn khi rót dung môi.
¾ Triển khai sắc ký:
- Cho máy bơm hoạt động. Rót một thể tích dung môi lên bề mặt phễu. Dung môi được hút xuống bình tam giác bên dưới. Chờ cho phễu khô tương đối, ngắt áp suất, rót phần dung môi vừa giải ly ra.
- Hệ dung môi giải ly:
- Cloroform 100%
- Etyl acetat 100%
- Etyl acetat – metanol (50 : 50)
- Thể tích phân đoạn giải ly: 500 ml.
- Kiểm tra các phân đoạn:
- Sắc ký lớp mỏng kiểm tra các phân đoạn. Hệ dung môi khai triển là etyl acetat – metanol – nước (100: 17: 13).
- Các phân đoạn giống nhau được gộp chung. Cô đến cắn và cân khối lượng.
2.2.4.3. Sắc ký cột cổđiển [11],[ 24]
Sau khi sắc ký cột nhanh, thu được các phân đoạn đơn giản hơn. Lựa chọn phân đoạn phù hợp, có thành phần đơn giản, chứa những hợp chất có hoạt tính chống oxi hóa để tiến hành sắc ký cột cổđiển phân lập các chất tinh khiết.
36 Bảng 2.3: Thông số sắc ký cột cổđiển. Khối lượng mẫu nạp 6 g Chất hấp phụ Silicagel hạt vừa (40 – 63 μm) Khối lượng chất hấp phụ 350 g Quy cách cột 4 x 50 cm
Dung môi ly giải Etyl acetat : metanol
Tốc độ dòng 20 giọt/phút
Thể tích mỗi phân đoạn 20 ml
2.2.5. Đánh giá hoạt tính chống oxi hóa
2.2.5.1. Phương pháp quét gốc tự do DPPH
Phương pháp quét gốc tự do DPPH là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện.
Phương pháp này dùng để thực hiện phản ứng mang tính chất sàng lọc tác dụng chống oxi hóa của mẫu nghiên cứu trong thử nghiệm ban đầu.
¾ Nguyên tắc:
DPPH là gốc tự do ổn định, không tự kết hợp đề tạo thành nhị nhân tử. Gốc tự do có màu tím nhờ vào điện tử N chưa ghép đôi. Chất có tác dụng chống oxi hóa sẽ làm giảm màu của DPPH. Sự mất màu này là do các gốc tự do DPPH đã kết hợp với một H của chất nghiên cứu để tạo thành DPPH dạng nguyên tử. Hoạt tính quét gốc tự do của chất nghiên cứu tỉ lệ thuận với độ mất màu của DPPH. Xác định bằng cách đo độ hấp thụở bước sóng 516 nm [8].
37
- Dung dịch DPPH: Pha dung dịch DPPH 0,6mM trong metanol bằng cách hòa tan 5,915mg DPPH vào 17,5ml MeOH cho vào bình định mức sau đó thêm nước cho đủ 25ml.
- Mẫu thử: Khảo sát hoạt tính quét gốc DPPH của các mẫu: cao tổng, cao eter, cao cloroform, cao etyl acetat và cao nước. Chứng dương là vitamin C. Các mẫu thử được tiến hành khảo sát ở 7 nồng độ khác nhau theo bảng 2.4
Bảng 2.4: Dãy nồng độ của các phân đoạn cao đem thử hoạt tính quét gốc tự
do DPPH. Mẫu thử Nồng độ gốc (μg/ml) Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 Ống5 Ống 6 Ống 7 Cao tổng 50 100 200 300 400 500 600 Cao eter 200 400 600 800 1000 1200 1400 Cao cloroform 200 300 400 500 600 700 800
Cao etyl acetat 50 75 100 125 150 175 200
Cao nước 200 300 400 500 600 700 800
vitamin C 10 15 20 25 30 35 40
¾ Tiến hành thí nghiệm
- Hút 0,5 ml mẫu thử vào ống nghiệm.
- Thêm vào 3 ml metanol.
- Cho vào ống nghiệm 0,5 ml dung dịch DPPH. Lắc đều.
- Mẫu được giữ trong tối, ở nhiệt độ phòng. Sau thời gian 30 phút, tiến hành đo độ hấp thu ở bước sóng 516 nm.
- Hoạt tính chống oxi hóa (HTCO) được tính theo công thức:
100 ) ( (%)= − × ODc ODt ODc HTCO
38
ODc: Mật độ quang của dung dịch DPPH và MeOH. ODt: Mật độ quang của DPPH và mẫu thử.
Từ HTCO (%) và nồng độ mẫu dựng được đường chuẩn. Dựa vào đường