3.2.1. Kết quả chiết xuất cao toàn phần
Thu nhận cao toàn phần theo phương pháp ngâm lạnh. 10kg lá Chùm ngây tươi được loại bỏ tạp, sâu, bụi…cho vào bình ngấm kiệt. Dung môi chiết là cồn 96% (theo tỉ lệ 6:1). Lượng dung môi sử dụng là 60 lít.
45
Bảng 3.7: Hiệu suất thu cao toàn phần từ lá Chùm Ngây Mẫu Khối lượng mẫu (kg) Khối lượng cao (g) Độẩm cao (%) Hiệu suất chiết Lá Chùm Ngây tươi 10 600 19,8 5,88%
3.2.2. Kết quả chiết cao phân đoạn
Từ cao cồn tổng ban đầu, tiến hành lắc phân đoạn lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: eter, cloroform, etyl acetat. Thu được các dịch lắc phân
đoạn có tính phân cực khác nhau, cô giảm áp các dịch lắc và phần dịch nước còn lại sau cùng ta thu được các cao eter, cao clorofom, cao etyl acetat, và cao nước.
Bảng 3.8: Kết quả thu cao phân đoạn bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng Phân đoạn Khối lượng cao (g) Độẩm cao (%) Hiệu suất chiết
Cao eter 168 10,53 28%
Cao cloroform 2,63 15,62 0,44 %
Cao etyl acetat 28,40 18,25 4,7 %
Cao nước 120 19,42 20 %
Bộ phận dùng là lá Chùm Ngây tươi, nên thành phần chiếm tỷ lệ cao trong cao cồn tổng sẽ là chlorophyl. Các chlorophyl có độ phân cực thấp nên hòa tan chủ
yếu phân đoạn eter, vì vậy cao eter chiếm khối lượng cao nhất trong các cao phân
đoạn thu được.
Cao cloroform có khối lượng nhỏ nhất cho thấy các chất có độ phân cực gần với độ phân cực của cloroform chiếm hàm lượng thấp trong lá Chùm Ngây.
46
Hình 3.1: Quy trình chiết cao cồn tổngvà thu cao phân đoạn từ lá Chùm Ngây.
Việc phân lập các nhóm hợp chất có hoạt tính sinh học của một đối tượng nghiên cứu nào đó thường bắt đầu từ việc khảo sát các đặc điểm hóa học quan trọng và hoạt tính sinh học trên các phân đoạn cao thu được. Nhằm định hướng cho việc phân lập các hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa trong lá Chùm Ngây, chúng tôi tiến hành khảo sát các phân đoạn cao. Mỗi phân đoạn cao sẽ được tiến hành xác định các nhóm hợp chất chính có mặt trong phân đoạn, định lượng phenolic tổng, định tính bằng sắc ký lớp mỏng và khảo sát hoạt tính chống oxy hóa. Từ kết quả thu
được sẽ lựa chọn ra phân đoạn có tiềm năng nhất để tiến hành tách chiết các hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa trong lá Chùm Ngây.
Với EtOAc Với cloroform Với eter Lắc phân đoạn Chiết cồn 96% Tỉ lệ 6 : 1 Lá Chùm ngây tươi 10 kg Cao cồn tổng m = 600 g Cao eter m = 168 g Cao cloroform m = 2,63 g
Cao etyl acetate m = 28,40 g
Cao nước m = 120 g
47
3.3. Kết quả khảo sát các cao phân đoạn
3.3.1. Kết quảđịnh tính hóa học các cao phân đoạn
Bảng 3.9: Kết quảđịnh tính hóa học các cao phân đoạn
Nhóm hợp chất Phản ứng định tính Hiện tượng Cao phân đoạn Eter Cloro- form Etyl acetat Nước Alkaloid Mayer Tủa trắng - ++ - - Dragendroff Tủa đỏ cam - + - - Bouchardart Tủa đỏ nâu - - - - Flavonoid H2SO4đđ Vàng/vàng cam - - ++ - NaOH 1% Vàng + + ++ - Cyanidin Đỏđậm - +++ - -
FeCl3 Xanh rêu + - +++ +
Anthraquinon NaOH Màu đỏ + +++ ++ -
Coumarin KOH 10% Phát huỳnh quang + + ++ +
Tanin Gelatin muối Tủa bông trắng - - - -
Steroid- triperpenoid Liebermann Burchard Cam - đỏ + ++ - - Rosenthaler Xanh lục – tím - - - - Salkowski Đỏđậm – xanh – xanh tím - +++ - -
Carr Price Màu đặc trưng - - - -
Saponin Lắc mạnh Bọt bền - - +++ +++ Fontan – Kaudel So sánh bọt trong cột acid/kiềm - - Ngang nhau Ngang nhau Chú thích: (-) âm tính (+) có ít (++) có (+++) có nhiều
48
Kết quảđịnh tính cho thấy:
- Trong phân đoạn cao eter có các hợp chất: Flavonoid, anthraquinon, coumarin, steroid – triterpenoid.
- Trong phân đoạn cao cloroform có mặt của các hợp chất: alkaloid, flavonoid, anthraquinon, coumarin, steroid – triterpenoid.
- Phân đoạn cao etyl acetat có các hợp chất: flavonoid, anthraquinon, coumarin, saponin triperpen. Thành phần không đa dạng như trong cao cloroform nhưng phản ứng rõ ràng hơn. Tập trung nhiều nhất là các hợp chất flavonoid.
- Phân đoạn nước có flavonoid, coumarin, saponin steroid. Flavonoid phần lớn
đã được giữ lại trong phân đoạn etyl acetat. Tuy nhiên một số flavonoid có gắn với phần tửđường nên độ phân cực của hợp chất tăng lên và nằm trong phân đoạn dịch nước còn lại.
3.3.2. Kết quảđịnh lượng phenolic
Cao cồn tổng và các cao phân đoạn được tiến hành định lượng phenolic tổng bằng phương pháp Folin – Ciocalteu.
9 Lập phương trình đường chuẩn acid gallic.
Bảng 3.10: Mối tương quan giữa hàm lượng acid gallic và giá trị OD 758 nm.
Hàm lượng acid gallic (μg) OD trung bình (758 nm)
10 0,132 20 0,285 30 0,410 40 0,582 50 0,685
49
Hình 3.2: Đường chuẩn acid gallic.
9 Định lượng phenolic tổng trong cao cồn tổng và cao phân đoạn
Dựa vào đường chuẩn acid gallic để xác định hàm lượng phenolic tổng có trong các phân đoạn cao. Phương trình hồi quy: y = 0,014x – 0,0021 R2 = 0,9955
Bảng 3.11: Hàm lượng phenolic tổng trong cao cồn tổng và cao phân đoạn
Mẫu Khối lượng cao (mg) OD 758 nm Hàm lượng phenolic tổng (μg GAE/mg) Cao tổng 0,4 0,483 108,011 Cao eter 0,4 0,221 44,528 Cao cloroform 0,4 0,522 110,914
Cao etyl acetat 0,1 0,309 271,822
Cao nước 0,4 0,408 90,881
Hàm lượng phenolic tổng trong cao cồn tổng là 108,011 μg GAE/mg (μg
đượng lượng acid gallic/ml), chiếm khoảng 8,6 % khối lượng cao. Kết quả cho thấy lá Chùm Ngây có chứa hàm lượng phenolic khá cao, vì vậy có tiềm năng là nguồn chất chống oxy hóa tự nhiên dồi dào.
50
Theo kết quả định lượng, trong các cao phân đoạn, hàm lượng phenolic tập trung nhiều nhất trong cao etyl acetat, 271,822 μg GAE/mg, chiếm khoảng 22,2% khối lượng cao. Đối chiếu với kết quả định tính hóa học phân đoạn có thể thấy các hợp chất có trong phân đoạn này là flavonoid, coumarin là những hợp chất thuộc nhóm phenolic. Vì thế, hàm lượng phenolic tổng trong phân đoạn etyl acetat cao nhất.
Phân đoạn cloroform có hàm lượng phenolic tổng cao thứ hai, 110,914 μg GAE/mg. Phân đoạn này cũng chứa khá nhiều các hợp chất phenolic, tuy nhiên các hợp chất phenolic này có độ phân cực kém hơn so với hợp chất phenolic trong cao etyl acetat. Dựa vào kết quả định tính chóa học các phân đoạn có thể dự đoán chúng là các anthraquinon và flavonoid dạng tự do.
Cao eter có hàm lượng phenolic tổng thấp nhất, 44,528 μg GAE/mg. Như
vậy ngoài những thành phần như chlorophyl, tạp, chất béo, phân đoạn này cũng có chứa một lượng ít các hợp chất phenolic kém phân cực. Các hợp chất này có thể là flavonoid, antraquinon, coumarin ở dạng tự do.
3.3.3. Kết quả sắc ký lớp mỏng các phân đoạn tổng các cao phân đoạn
¾ Hệ 1: Etyl acetat – metanol – nước (100 : 17 : 13)
UV 254 nm UV 365 nm Thuốc thử FeCl3
Hình 3.3: Sắc ký lớp mỏng cao cồn tổng và cao phân đoạn (hệ 1)
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
51
1: Cao cồn tổng 2: Cao eter 3: Cao cloroform
4: Cao etyl acetat 5: Cao nước
• Dưới đèn UV254 nm:
- Cao cồn tổng có 4 vết chất tắt quang với Rf lần lượt là: 0,11; 0,28; 0,43; 0,82.
- Phân đoạn cao eter có 1 vết chất, Rf = 0,82.
- Cao cloroform không có vết chất.
- Cao EtOAc là nhiều vết chất nhất, các vết chất này tương đồng với các vết trong cao tổng, nhưng đậm hơn và rõ hơn vì trong phân đoạn này, các chất
đã được giàu hóa.
- Cao nước có 2 vết chất với Rf là 0,29 và 0,12.
• Dưới đèn UV 365 nm:
- Cao cồn tổng chỉ quan sát thấy 1 vết phát quang màu xanh dương có Rf = 0,34. Các vết còn lại nằm tập trung ở phía trên của sắc đồ, có màu cam. Đây là các chlorophyl. Vì cao cồn tổng được chiết từ lá nên lượng chlorophyl trong cao tổng là rất lớn.
- Cao eter có vết chất phát quang màu cam, tương ứng với các chlorophyl trong cao tổng.
- Cao chloroform có 1 vết chất phát quang màu xanh dương Rf = 0,47.
- Cao EtOAc có nhiều vết chất nhất (giá trị Rf trình bày trong mục 3.4.1).
- Cao nước có các 4 vết phát quang màu xanh dương có Rf lần lượt là 0,70 ; 0,47 ; 0,35 ; 0,23.
• Thuốc thử FeCl3:
- Thuốc thử FeCl3 dùng để phát hiện phần lớn các hợp chất phenolic. Quan sát sắc đồ ta thấy các vết chất bắt màu rêu với thuốc thử chủ yếu tập trung trong phân đoạn etyl acetat. Vì thành phần các chất này trong cao tổng ít hơn rất nhiều so với chlorophyl nên không thể quan sát thấy các vết chất này ở sắc
đồ của cao tổng. Chỉ đến phân đoạn etyl acetat, chúng được giàu hóa và có thể hiện rõ trên sắc đồ.
52
- Trong phân đoạn cao eter, vết Rf = 0,82 có bắt màu rêu với thuốc thử, cho thấy ngoài chlorophyl, còn có các hợp chất phenolic khác. Vì đây là các phenolic ở dạng tự do nên độ phân cực của chúng thấp, và hệ 1 là hệ khai triển có tính phân cực cao nên các chất này tập trung lại ở phần trên của sắc
đồ, trùng lắp với các chlorophyl.
¾Hệ 2: Etyl acetat – acid formic – acid acetic – nước (100 : 11 : 11 : 27)
UV 254 nm UV 365 nm Thuốc thử FeCl3
Hình 3.4: Sắc ký lớp mỏng cao tổng và cao phân đoạn (hệ 2).
So với hệ 1, hệ 2 cho sắc đồ không trãi dài từ vùng kém phân cực đến phân cực nhưng không rõ bằng, các chất phân tách không rõ ràng, có hiện tượng kéo vệt.
• Dưới đèn UV 254 nm:
- Cao tổng có có 2 vết nhạt, Rf lần lượt là 0,12; 0,29; 0,35.
- Cao eter các vết tập trung ở vùng trên của sắc đồ.
- Cao EtOAc có nhiều vết chất nhất. Các vết có Rf lần lượt là 0,85 ; 0,59 ; 0,35 nằm ở phần trên cùa sắc đồ, không có những vệt tương ứng trong cao tổng. Vì trong cao tổng, các chất này chiếm tỷ lệ nhỏ, đến phân đoạn EtOAc chúng mới được giàu hóa. Các vết có Rf là 0,29 ; 0,12 phân bốở phần dưới của sắc
53
đồ, có vệt to, đậm, và tương ứng với những vệt trong cao tổng. Chúng là những hợp chất có độ phân cực lớn và chiếm tỉ lệ cao trong phân đoạn này.
• Dưới đèn UV 365 nm:
- Cao eter có các vết chất phát quang màu đỏ, đó là các tạp chlorophyl.
- Cao cloroform có 4 vết chất phát quang màu xanh dương, có Rf lần lượt là 0,80 ; 0,64 ; 0,41 ; 0,31.
- Cao EtOAc có nhiều vết chất nhất. Vết chất Rf = 0,29 tắt quang ở bước sóng 254 nm, cũng tắt quang ở bước sóng 365 nm. Các vết chất còn lại có màu xanh dương, không nhìn thấy dưới đèn 254 nm, chúng có Rf lần lượt là 0,80 ; 0,58 ; 0,32 ; 0,21 ; 0,05.
- Cao nước có 4 vết phát quang màu xanh dương có Rf lần lượt là 0,76 ; 0,35; 0,32 ; 0,05.
• Thuốc thử FeCl3:
- Khi nhúng thuốc thử FeCl3, chỉ trong phân đoạn EtOAc, các chất tắt quang dưới bước sóng 254 nm nằm ở phần dưới sắc đồ là bắt màu với thuốc thử. Từ kết quả sắc ký lớp mỏng có thể thấy các hợp chất phenolic chủ yếu tập trung trong phân đoạn etyl acetat. Các vết chất tập trung ở phần nửa dưới của sắc đồ
chứng tỏ các hợp chất trong phân đoạn có độ phân cực cao.
3.3.4. Kết quả sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa các cao phân đoạn
Sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa của các phân đoạn cao bằng phản ứng quét gốc tự do DPPH. Chúng tôi lựa chọn phương pháp này vì đây là phương pháp đơn giản, tiến hành nhanh, và đánh giá được hoạt tính chống oxy hóa của các phân đoạn. Khả năng chống oxy hóa của một chất càng mạnh khi khả năng cho proton H+ của chất đó sang tác nhân oxy hóa, một gốc tự do, càng cao. Trong phản ứng này, DPPH được xem như một gốc tự do cần H+. DPPH sẽ mất màu tím khi đã nhận thêm được 1 H+, nghĩa là gốc tự do đã bị loại trừ nhờ chất chống oxy hóa.
Khả năng chống oxy hóa của cao cồn tổng và các cao phân đoạn được khảo sát trên nhiều nồng độ khác nhau, từđó xác định được khoảng tuyến tính giữa nồng
54
Bảng 3.12: Thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH trên cao cồn tổng Mẫu cao cồn tổng Ống Nồng độ (μg/ml) OD trung bình HTCO (%) Mẫu Phản ứng Chứng 0 0 0,808 1 50 12,5 0,689 14,728 2 100 25 0,641 20,668 3 200 50 0,542 32,921 4 300 75 0,452 44,059 5 400 100 0,398 50,743 6 500 125 0,291 63,985 7 600 150 0,241 70,173 Hình 3.5: Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao cồn tổng
55
Bảng 3.13: Thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH trên cao eter. Mẫu cao eter Ống Nồng độ (μg/ml) OD trung bình HTCO (%) Mẫu Phản ứng Chứng 0 0 0,836 1 200 50 0,756 9,569 2 400 100 0,702 16,029 3 600 150 0,600 28,230 4 800 200 0,519 37.919 5 1000 250 0,464 44,498 6 1200 300 0,404 51,675 7 1400 350 0,344 58,852
56
Bảng 3.14: Thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH trên cao cloroform Mẫu cao cloroform Ống Nồng độ (μg/ml) OD trung bình HTCO (%) Mẫu Phản ứng Chứng 0 0 0,773 1 200 50 0,559 27,684 2 300 75 0,519 32,859 3 400 100 0,461 40,362 4 500 125 0,414 46,442 5 600 150 0,390 49,547 6 700 175 0,343 55,627 7 800 200 0,300 61,190
57
Bảng 3.15: Thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH trên cao etyl acetat Mẫu cao etyl acetat
Ống Nồng độ (μg/ml) OD trung bình HTCO (%) Mẫu Phản ứng Chứng 0 0 0,794 1 50 12,50 0,561 29,345 2 75 18,75 0,495 37,657 3 100 25,00 0,385 51,511 4 125 31,25 0,280 64,736 5 150 37,50 0,218 72,544 6 175 43,75 0,143 81,990 7 200 50,00 0,082 89,673
58
Bảng 3.16: Thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH trên cao nước Mẫu cao nước Ống Nồng độ (μg/ml) OD trung bình HTCO (%) Mẫu Phản ứng Chứng 0 0 0,836 1 200 50 0,768 8,134 2 300 75 0,703 15,909 3 400 100 0,638 23,684 4 500 125 0,578 30,861 5 600 150 0,556 33,493 6 700 175 0,490 41,388 7 800 200 0,432 48,325
59
Bảng 3.17: Thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH trên vitamin C Chứng dương vitamin C Ống Nồng độ (μg/ml) OD trung bình HTCO (%) Mẫu Phản ứng Chứng 0 0 0,791 1 10 2,50 0,672 15,044 2 15 3,75 0,633 19,975 3 20 5,00 0,553 30,088 4 25 6,25 0,485 38,685 5 30 7,50 0,380 51,960 6 35 8,75 0,302 61,820 7 40 10,00 0,239 69,785 Hình 3.10: Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của vitamin C.
60
Dựa vào phương trình hồi quy, tính được giá trị IC50 là nồng độ quét được 50% gốc tự do DPPH. Các mẫu có giá trị IC50 càng thấp thì hoạt tính chống oxy hóa càng cao.
Bảng 3.18: Giá trị IC50 của cao cồn tổngvà các cao phân đoạn
Mẫu Giá trị IC 50
(μg/ml)
Cao cồn tổng 95,26
Cao eter 287,79
Cao cloroform 148,35
Cao etyl acetat 24,59
Cao nước 206,69
Vitamin C 7,41
Hình 3.11: Giá trị IC50 về hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao cồn tổng và các cao phân đoạn.
61
- Theo kết quả ở bảng 3.17 và hình 3.9, IC50 của cao cồn tổng là 95,26 μg/ml, của vitamin C là 7,41 μg/ml cho thấy cao cồn tổng từ lá Chùm Ngây có hoạt tính chống oxy hóa khá cao.
- Trong các cao phân đoạn, cao etyl acetat là có hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất 24,59 μg/ml, tiếp đó là cao phân đoạn cloroform