2.2.1. Xây dựng tiêu chẩn nguyên liệu
2.2.1.1. Xác định độẩm bột dược liệu [5]
- Cân trọng lượng bì.
- Cân chính xác vào bì khoảng 2g mẫu.
- Sấy mẫu ở áp suất thường, 1050C trong 4 giờ, lấy ra để trong bình hút ẩm và đem cân trọng lượng sau khi sấy. Ghi lại lượng cân.
- Tiếp tục sấy mẫu ở áp suất thường, 1050C trong 2 giờ, để vào bình hút ẩm chờ nguội và cân lại trọng lượng sau khi sấy. Lặp lại nhiều lần, mỗi lần sấy 2 giờ, cho đến khi khối lượng không thay đổi.
- Độẩm của mẫu được tính theo công thức sau: % 100 ) ( − × − = a c b a X X: độẩm mẫu thử (%). a: khối lượng ban đầu của mẫu thử (g). b: khối lượng sau cùng của mẫu thử (g). c: khối lượng bì (g). 2.2.1.2. Xác định độ tro toàn phần [5]
- Nung một chén nung bằng sứ cho đến khi khối lượng không đổi, để nguội trong bình hút ẩm và cân khối lượng của chén không.
- Cân chính xác 2g mẫu cho vào chén nung. Trải đều mẫu dưới đáy chén và đốt cẩn thận trên bếp điện cho đến khi mẫu cháy hoàn toàn và chén không còn bốc khói.
- Dùng kẹp sắt dài đưa chén vào lò nung ở 500 – 6000C cho đến khi vô cơ hóa hoàn toàn (tro không còn màu đen). Dùng kẹp sắt lấy chén nung ra, để nguội khoảng 30 phút trong bình hút ẩm. Cân và ghi lại lượng cân.
- Đặt chén đựng tro vào lò nung và tiếp tục nung ở nhiệt độ trên trong 1 giờ nữa. Lấy chén ra, để nguội trong bình hút ẩm. Cân.
24
- Tiếp tục làm như vậy cho đến khi kết quả 2 lần cân liên tiếp, khối lượng chén tro không chênh lệch quá 0,5 mg.
- Tro toàn phần được tính theo công thức:
( )) 100% ( × × − − = h c c b a A A: Độ tro toàn phần (%). a: Khối lượng chén có tro (g). b: Khối lượng chén không tro (g). c: Khối lượng mẫu (g).
h: Độẩm (%)
2.2.1.3. Xác định độ trong không tan trong acid clohydric [3]
- Lấy chén nung đã xác định tro toàn phần ở trên, thêm vào đó 15ml nước cất và 10 ml HCl 10%. Đậy chén bằng một mặt kính đồng hồ, đun sôi cẩn thận trong 10 phút. Để nguội. Rửa mặt kính đồng hồ bằng 5ml nước cất rồi cho vào chén nung.
- Lọc chất không tan bằng giấy lọc không tro. Rửa giấy lọc và tro bằng nước cất nóng cho tới khi dịch lọc trung tính (thử bằng giấy quỳ).
- Cho tất cả giấy lọc và tro trở lại chén nung, sấy khô rồi đốt, nung ở 500 – 6000C trong 2h. Để nguội trong bình hút ẩm và cân.
- Nung tiếp cho đến khi giữa hai lần cân liên tiếp, khối lượng không chệnh lệch nhau quá 1mg.
- Tính tỉ lệ phần trăm tro không tan trong acid với tro tan trong acid so với lượng mẫu đã sử dụng.
2.2.1.4. Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật [3], [5], [9], [10]
Dựa vào độ hòa tan của các hợp chất trong dược liệu để tách chúng bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần: kém phân cực, phân cực trung bình, phân cực mạnh bằng cách chiết lần lượt với các dung môi: dietyl eter, cồn và nước. Sau đó xác định các hợp chất trong từng dịch chiết bằng các phản ứng đặc trưng.
25
Nhóm hợp chất Thuốc thử / cách phát hiện Phản ứng dương tính
Tinh dầu Bốc hơi tới cắn Có mùi thơm
Acid béo Nhỏ dung dịch lên giấy Vết trong mờ
Carotenoid H2SO4đậm đặc Màu xanh dương đậm
Triterpenoid Liebermann – Burchard
Lớp tiếp xúc có màu đỏ nâu, lớp dung dịch trên có
màu xanh lục hay tím Alkaloid Thuốc thử Mayer Thuốc thử Bouchardat Thuốc thử Dragendorff Tủa trắng – vàng nhạt Tủa nâu đỏ Tủa đỏ cam
Coumarin KOH 10% Phát huỳnh quang mạnh
dưới đèn tử ngoại 365 nm
Anthraquinon NaOH 10% Tăng màu
Tanin Dung dịch FeCl3 Màu xanh rêu
Flavonoid Mg, HCl đậm đặc Màu hồng tới đỏ
Saponin Lắc mạnh Tạo bọt bền
Chất khử Fehling A, Fehling B Tủa đỏ gạch
Acid hữu cơ Na2CO3 Sủi bọt khí
Polyuronid Cồn 960 Tủa bông
2.2.2 Phương pháp chiết xuất dược liệu và thu phân đoạn cao
2.2.2.1 Chiết xuất cao toàn phần
Thu cao toàn phần bằng phương pháp chiết ngâm dầm, với dung môi chiết là cồn 96%, theo tỉ lệ 6 : 1.
Cân 10 kg lá Chùm ngây tươi cho vào bình ngấm có lót bông ởđáy. Rót dung môi vào bình cho đến xấp xấp bề mặt của mẫu. Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một ngày cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên. Thu dịch chiết và tiếp tục rót dung môi mới vào bình. Gộp dịch chiết lại,
26
đem cô giảm áp để thu hồi dung môi và có được cao toàn phần (cao cồn tổng) [5], [10].
2.2.2.2 Chiết cao phân đoạn từ cao toàn phần [5], [10]
Cao cồn tổng ban đầu chứa hầu hết các hợp chất hữu cơ từ phân cực đến kém phân cực. Sử dụng kỹ thuật chiết lỏng – lỏng để phân chia cao cồn tổng ban đầu thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau.
Việc chiết lỏng – lỏng được thực hiện trong bình lắng gạn, ởđiều kiện nhiệt độ phòng.
Hòa tan cao cồn tổng cồn vào một lượng tối thiểu cồn, sau đó rót thêm một lượng lớn nước.
Lắc phân đoạn phần dịch này lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: Dietyl eter, Cloroform, Etyl acetat. Tiến hành lắc cho đến khi không còn chất hòa tan vào dung môi thì mới chuyển sang dung môi phân cực hơn.
Thu các phân đoạn, đem cô giảm áp để loại dung môi. Ta thu được 4 phân đoạn cao: cao Eter, cao Cloroform, cao Etyl acetat và phần dịch lắc còn lại sau cùng là cao nước [5], [10].
Tóm tắt quay trình theo sơđồ trong hình 2.1.
Các phân đoạn cao thu được sẽđược khảo sát các thành phần hóa học và thử hoạt tính chống oxi hóa nhằm chọn ra phân đoạn có tiềm năng cao nhất. Phân đoạn này sẽ tiếp tục được phân tích để xác định và tách chiết ra các hợp chất có hoạt tính chống oxi hóa.
2.2.3 Khảo sát các cao phân đoạn
2.2.3.1. Định tính bằng phương pháp hóa học cao phân đoạn
Các phân đoạn cao Eter, cao Cloroform, cao Etyl acetat, cao nước được đem phân tích định tính sự hiện diện của các nhóm chất chính đã cho kết quả dương tính trong phần khảo sát sơ bộ hóa thực vật.
27
Hòa mỗi cao phân đoạn trong 4 ml dung dịch acid hydrocloric1%. Chia dung dịch acid vào 4 ống nghiệm nhỏ. Định tính alkaloid bằng các thuốc thử Mayer, Bouchardat, Dragendorff [3].
Hình 2.1: Quy trình chiết xuất cao phân đoạn từ lá Chùm ngây tươi.
- Thuốc thử Mayer: tủa trắng – vàng nhạt
- Thuốc thử Bouchardat: tủa đỏ nâu
- Thuốc thử Dragendorff: tủa đỏ cam
Lắc phân đoạn Chiết cồn 96% Tỉ lệ 6 : 1 Dịch lắc eter Lá Chùm ngây tươi 10 kg Bã dược liệu Dịch cồn Cao cồn tổng Cô giảm áp Dịch lắc
cloroform etyl acetat Dịch lắc
Dịch nước còn lại
Cô giảm áp Cô giảm áp Cô giảm áp Cô giảm áp
28
So sánh kết quả với ống chứng không có thuốc thử. Nếu dung dịch đục hơn so với ống chứng hoặc có tủa: có alkaloid.
• Xác định nhóm Flavonoid:
¾ Tác dụng với H2SO4đậm đặc:
Hòa tan mỗi cao phân đoạn vào H2SO4 đậm đặc: flavon và flavonol cho màu vàng đậm đến vàng cam và có phát huỳnh quang đặc biệt. Chalcon, auron cho màu đỏ hoặc xanh dương – đỏ. Flavanon cho màu từ cam đến đỏ.
¾ Tác dụng với dung dịch NaOH 1% / etanol:
Nhỏ dung dịch NaOH vào một dung dịch có cao đã hòa tan trong etanol, sẽ có màu từ vàng đến cam - đỏ. Nếu là flavon, isoflavon, chalcon, leucoantocyanidin sẽ có màu vàng. Flavonol cho màu từ vàng đến cam. Auron cho màu đỏđến đỏ tím.
¾ Phản ứng cyanidin của Wilstatter:
Chuẩn bị 2 ống nghiệm, cho vào mỗi ống 2 ml cao chiết hòa tan trong methanol. Ống 1 làm đối chứng. Với ống số 2: cho thêm 1 ml alcol tert – butyl, 0.5ml HCl đậm đặc, 3-5 hạt magnesium kim loại. Đun nhẹ trong vài phút , sẽ xuất hiện màu ở lớp alcol phía trên.
Nếu cao chiết có chứa flavon, flavanon, flavonol, flavanonol, xanthon dung dịch trong ống 2 sẽ có màu cam, đỏ hoặc tím. Nếu cao chiết có chứa isoflavon, isoflavanon, auron dung dịch không đổi màu.
¾ Tác dụng với FeCl3:
Phản ứng cho màu từ xanh lục đến xanh đen • Xác định nhóm polyphenol:
¾ Anthraquinon:
Phản ứng Liebermann: Hòa cao vào dung dịch NaOH 10% lắc đều và pha loãng với nước. Thêm vào một ít bột kẽm và đun sôi dung dịch. Anthraquinon làm dung dịch có màu đỏ. Màu sẽ mất khi lắc dung dịch ngoài không khí và xuất hiện trở lại khi đun nóng.
29
¾ Coumarin:
Hòa cao trong 2ml cồn 70%. Chia đều dịch chiết vào 2 ống nghiệm nhỏ. Thêm vào ống thứ nhất 0.5ml KOH10% và ống thứ hai một lượng nước cất tương đương. Đun cách thủy cả 2 ống nghiệm trong 2 phút, để nguội và soi dưới đèn tử ngoại 365nm. Dung dịch trong ống một phát huỳnh quang mạnh hơn dung dịch trong ống thứ 2 là có coumarin.
¾ Tannin :
Lấy 2ml dịch lọc, thêm vào 5 giọt dung dịch gelatin – muối, khuấy đều, so sánh với ống chứng chỉ chứa dịch lọc và ống chứng chỉ chứa thuốc thử (dung dịch gelatin – muối). Nếu có tủa bông trắng là có tannin.
• Xác định nhóm terpenoid:
¾ Phản ứng Liebermann – Burchard để phát hiện steroid –
triterpenoid:
Anhydrid acetic (1ml), chloroform (1ml), làm lạnh ống nghiệm rồi thêm 1 giọt H2SO4 đđ. Cho mẫu vào ở dạng rắn. Phản ứng dương tính là dung dịch đổi thành màu xanh dương, lục, cam hoặc đỏ, màu này bền không đổi.
¾ Phảnứng Rosenthler để phát hiện steroid – triterpenoid:
Dung dịch mẫu thử (1ml), dung dịch 1% vanilin trong etanol (2 giọt), HCl đậm đặc (1 giọt). Phản ứng dương tính là dung dịch đổi thành màu xanh lục hay tím.
¾ Phảnứng Salkowski để phát hiện steroid:
Hòa tan mẫu thử (1-2mg) trong cloroform (1ml) và nhỏ thêm vào H2SO4 đđ (1ml). Phản ứng dương tính là dung dịch đổi thành màu đỏđậm, xanh, xanh tím.
¾ Phảnứng Carr – Price để phát hiện steroid – triterpenoid:
Dung dịch mẫu thử (1ml), dung dịch 20% SnCl3 trong cloroform (1-2 giọt), nếu có màu đặc trưng, bền , khi so với ống chứng là dương tính.
30
• Xác định hợp chất saponin:
¾ Thửnghiệm tính tạo bọt:
Hòa tan cao vào 5ml nước nóng. Lọc vào một ống nghiệm và để nguội, thêm nước cho đủ 10ml, dùng ngón tay bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh, dứt khoát theo chiều dọc ống nghiệm trong 1 phút. Để yên ống nghiệm, quan sát lớp bọt và đánh giá kết quả.
Đánh giá kết quả:
- Bọt bền trong 15 phút: +
- Bọt bền trong 30 phút: ++
- Bọt bền trong 60 phút:+++
¾ Thử nghiệm Fontan – Kaudel:
Lấy một lượng cao hòa tan với 10ml nước. Chia đều vào 2 ống nghiệm. Ống 1: thêm 2ml HCl 0,5N (pH=1).
Ống 2: thêm 2ml NaOH 0,5N (pH=13).
Lắc trong 1 phút , quan sát và so sánh chiều cao cột bọt giữa 2 ống:
- Nếu cột bọt trong 2 ống tương đương nhau: sơ bộ kết luận dược liệu có saponin triterpen.
- Nếu ống 2 (pH=13) có cột bọt cao hơn ống 1 (pH=1) gấp 2-3 lần: sơ bộ kết luận dược liệu có saponin steroid.
2.2.3.2. Sắc ký lớp mỏng (SKLM) [3], [9] ¾ Chuẩn bị bản mỏng ¾ Chuẩn bị bản mỏng
Sử dụng bản mỏng silicagel – 60 F254, quãng đường di chuyển của dung môi là 8,5 cm.
¾ Chuẩn bị dung dịch mẫu Mẫu được hòa tan trong metanol. ¾ Hệ dung môi khai triển
31
- Hệ 2: Etyl acetat – acid formic – acid acetic – nước (100 : 11 : 11 : 27) ¾ Phát hiện
- Soi đèn UV 254 nm.
- Soi đèn UV 365 nm.
- Thuốc thử FeCl3 5% trong cồn.
2.2.3.3 Phương pháp định lượng phenolic tổng
Hàm lượng phenolic tổng được xác định bằng phương pháp Folin-Ciocalteu theo Waterman và Mole (1994) [18].
¾ Nguyên tắc:
Trong thành phần thuốc thử Folin-Ciocalteu có phức hợp phospho-wolfram- phosphomolybdat. Phức hợp này sẽ bị khử bởi các hợp chất phenolic tạo thành sản phẩm phản ứng có màu xanh dương, hấp thụ cực đại ở bước sóng 758 nm. Hàm lượng phenolic có trong mẫu tỉ lệ thuận với cường độ màu.
¾ Hóa chất:
- Thuốc thử Folin-Ciocalteu.
- Dung dịch Na2CO3 20%.
- Chất chuẩn acid gallic. ¾ Tiến hành thí nghiệm:
- Hút một thể tích xác định mẫu (Chất chuẩn acid gallic hoặc mẫu cần định lượng được pha loãng ở nồng độ thích hợp) cho vào bình định mức 10 ml.
- Thêm 6 ml nước cất vào bình định mức. Lắc đều.
- Cho vào bình 0,5 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu. Lắc đều. Để yên trong 5 phút.
- Thêm vào bình định mức 1,5 ml Na2CO3. Lắc đều.
- Thêm nước vào bình cho vừa đủ 10ml. Lắc đều.
32
9 Dựng đường chuẩn acid gallic Pha dung dịch chuẩn:
Cân 20 mg acid gallic, định mức chính xác đến 10 ml bằng nước cất, được dung dịch có nồng độ 2 mg/ml. Pha loãng tiếp 10 lần được dung dịch có nồng độ 0,2 mg/ml.
Từ dung dịch chuẩn này, hút vào bình định mức những thể tích khác nhau để được giai mẫu có hàm lượng acid gallic là 10 μg, 20 μg, 30 μg, 40 μg, 50 μg.
Tiếp tục tiến hành thí nghiệm như trên.
Bảng 2.1: Quy trình dựng đường chuẩn acid gallic.
Bình định mức 1 2 3 4 5 6
Hút từ dung dịch chuẩn (μl) 0 50 100 150 200 250
Hàm lượng acid gallic (μg) 0 10 20 30 40 50
Nước cất (ml) 6 6 6 6 6 6
Thuốc thửFolin-Ciocalteu (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Lắc đều, để yên 5 phút
Dung dịch Na2CO3 (ml) 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5
Định mức bằng nước cất đế 10ml. Để yên trong tối 2h Đo OD758 nm
9 Định lượng phenolic tổng trong cao cồn tổng và cao phân đoạn
Xác định hàm lượng phenolic tổng trong cao cồn tổng và các cao phân đoạn: cao Eter, cao Cloroform, cao Etyl acetat và cao nước.
Pha nồng độ dung dịch mẫu theo bảng 2.2.
Bảng 2.2: Nồng độ các cao phân đoạn đem định lượng. Mẫu Nồng độ (μg/ml) Hút vào bình định mức (μl) Khối lượng cao định lượng (mg) Cao tổng 2000 200 0,4 Cao Ether 2000 200 0,4
33
Cao Cloroform 2000 200 0,4
Cao Ethyl acetate 2000 50 0,1
Cao nước 2000 200 0,4
Tiếp tục tiến hành thí nghiệm theo các bước nêu trên.
Dựa vào đường chẩn acid gallic để xác định hàm lượng phenolic tổng có trong mẫu. Hàm lượng phenolic tổng được tính bằng đương lượng acid gallic (GAE) có trong 1 mg cao đem định lượng, theo công thức:
P: hàm lượng phenolic tổng (μg GAE/mg). m: khối lượng cao đem định lượng (mg). f(A): phương trình đường chuẩn.
X: độẩm cao (%)
2.2.4 Phân lập các hợp chất chống oxi hóa
2.2.4.1. Xác định các thành phần có hoạt tính chống oxi hóa bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng pháp sắc ký lớp mỏng
Sau khi khảo sát các phân đoạn cao, xác định được phân đoạn có tiềm năng chống oxi hóa cao nhất. Phân đoạn cao được chọn sẽđược khảo sát tiếp để xác định các thành phần có hoạt tính chống oxi hóa bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng.
Mẫu cao được hòa trong metanol. Tải lên bản mỏng sắc ký có chiều dài 10 cm, đường di chuyển cùa dung môi là 8,5 cm.
Hệ dung môi khai triển: Etyl acetat – metanol – nước (100 : 17 : 13)
Sau khi khai trển, bản mỏng được quan sát dưới đèn UV 254 nm và UV 365 nm. Các vết chất được ghi nhận bằng giá trị Rf của chúng.
Phun thuốc thử DPPH 0,05% lên bề mặt của bản mỏng. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
Những thành phần có hoạt tính chống oxi hóa sẽ tạo những vạch màu vàng trên nền tím của bản mỏng, do chất chống oxi hóa làm mất màu tím của thuốc thử
34
DPPH. Dựa vào những vạch này, có thể xác định được những thành phần có hoạt