Phương pháp quét gốc tự do DPPH là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện.
Phương pháp này dùng để thực hiện phản ứng mang tính chất sàng lọc tác dụng chống oxi hóa của mẫu nghiên cứu trong thử nghiệm ban đầu.
¾ Nguyên tắc:
DPPH là gốc tự do ổn định, không tự kết hợp đề tạo thành nhị nhân tử. Gốc tự do có màu tím nhờ vào điện tử N chưa ghép đôi. Chất có tác dụng chống oxi hóa sẽ làm giảm màu của DPPH. Sự mất màu này là do các gốc tự do DPPH đã kết hợp với một H của chất nghiên cứu để tạo thành DPPH dạng nguyên tử. Hoạt tính quét gốc tự do của chất nghiên cứu tỉ lệ thuận với độ mất màu của DPPH. Xác định bằng cách đo độ hấp thụở bước sóng 516 nm [8].
37
- Dung dịch DPPH: Pha dung dịch DPPH 0,6mM trong metanol bằng cách hòa tan 5,915mg DPPH vào 17,5ml MeOH cho vào bình định mức sau đó thêm nước cho đủ 25ml.
- Mẫu thử: Khảo sát hoạt tính quét gốc DPPH của các mẫu: cao tổng, cao eter, cao cloroform, cao etyl acetat và cao nước. Chứng dương là vitamin C. Các mẫu thử được tiến hành khảo sát ở 7 nồng độ khác nhau theo bảng 2.4
Bảng 2.4: Dãy nồng độ của các phân đoạn cao đem thử hoạt tính quét gốc tự
do DPPH. Mẫu thử Nồng độ gốc (μg/ml) Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 Ống5 Ống 6 Ống 7 Cao tổng 50 100 200 300 400 500 600 Cao eter 200 400 600 800 1000 1200 1400 Cao cloroform 200 300 400 500 600 700 800
Cao etyl acetat 50 75 100 125 150 175 200
Cao nước 200 300 400 500 600 700 800
vitamin C 10 15 20 25 30 35 40
¾ Tiến hành thí nghiệm
- Hút 0,5 ml mẫu thử vào ống nghiệm.
- Thêm vào 3 ml metanol.
- Cho vào ống nghiệm 0,5 ml dung dịch DPPH. Lắc đều.
- Mẫu được giữ trong tối, ở nhiệt độ phòng. Sau thời gian 30 phút, tiến hành đo độ hấp thu ở bước sóng 516 nm.
- Hoạt tính chống oxi hóa (HTCO) được tính theo công thức:
100 ) ( (%)= − × ODc ODt ODc HTCO
38
ODc: Mật độ quang của dung dịch DPPH và MeOH. ODt: Mật độ quang của DPPH và mẫu thử.
Từ HTCO (%) và nồng độ mẫu dựng được đường chuẩn. Dựa vào đường chuẩn tính được IC50 (khả năng đánh bắt 50% DPPH của mẫu). Giá trị IC50 càng thấp tương ứng với HTCO càng cao và ngược lại.
Bảng 2.5: Quy trình thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH Ống trắng Ống chứng Ống mẫu thử với dãy nồng độ thích hợp Mẫu (ml) 0 0 0,5 Metanol (ml) 4 3,5 3 Dung dịch DPPH (ml) 0 0,5 0,5
Để trong tối, ở nhiệt độ phòng trong 30 phút Đo OD 516 nm