Với những cao chiết từ cây có có nhiều hợp chất khác nhau, ít có phương pháp sắc ký cột hiệu quả chỉ một lần mà tách ra được các đơn chất nên phải thực hiện nhiều lần sắc ký cột. Đối với lượng mẫu cao lớn thì phải tốn nhiều thời gian (nhiều ngày) thực hiện sắc ký cột. Việc gián đoạn để nghỉ có thể làm xáo trộn vị trí sắp xếp của các chất trong quá trình sắc ký. Sắc ký nhanh cột khô được áp dụng để khắc phục những nhược điểm này [5], [9].
Sau khi tiến hành khảo sát phân đoạn có hoạt tính chống oxi hóa cao (phân đoạn etyl acetat), xác định được Rf của các thành phần có hoạt tính chống oxi hóa. Tiến hành sắc ký nhanh – cột khô để bước đầu tách thành những phân đoạn có độ phân cực khác nhau, thành phần đơn giản hơn. Từ những phân đoạn đơn giản này, dễ dàng phân lập tiếp các chất có hoạt tính chống oxi hóa bằng sắc ký cột cố điển một cách hiệu quả hơn.
Cách tiến hành
¾ Chuẩn bị cột sắc ký, dụng cụ:
- Phễu Buchner thành cao đường kính trong 10 cm.
- Bình tam giác.
- Máy hút chân không áp suất 70 mmHg. ¾ Chuẩn bị chất hấp phụ:
- Silicagel hạt vừa 40 – 60 μm.
- Chất hấp phụ được nhồi vào cột theo phương pháp bột khô. Chiều cao lớp hấp phụ: 5 cm.
35
- Nén chặt chất hấp phụ bằng cách gõ cột, kết hợp với áp suất hút ở phía dưới cột và nén cơ học trên định cột. Đặt phía trên bề mặt chất hấp phụ một miếng giấy lọc đểổn định mặt cột.
¾ Nạp mẫu:
- Khối lượng mẫu 20 g.
- Nạp mẫu ở dạng bột khô. Cho hết lượng mẫu khô phủ lên trên đầu cột, vừa khỏ nhẹ thành ngoài của phễu vừa dùng muỗng để trải đều phần bột này để có một lớp mỏng. Đặt lên trên bề mặt cột một miếng giấy lọc để bề mặt không bị xáo trộn khi rót dung môi.
¾ Triển khai sắc ký:
- Cho máy bơm hoạt động. Rót một thể tích dung môi lên bề mặt phễu. Dung môi được hút xuống bình tam giác bên dưới. Chờ cho phễu khô tương đối, ngắt áp suất, rót phần dung môi vừa giải ly ra.
- Hệ dung môi giải ly:
- Cloroform 100%
- Etyl acetat 100%
- Etyl acetat – metanol (50 : 50)
- Thể tích phân đoạn giải ly: 500 ml.
- Kiểm tra các phân đoạn:
- Sắc ký lớp mỏng kiểm tra các phân đoạn. Hệ dung môi khai triển là etyl acetat – metanol – nước (100: 17: 13).
- Các phân đoạn giống nhau được gộp chung. Cô đến cắn và cân khối lượng.