II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1 Nguyên liệu
4. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hĩa của các dịch trích từ thực vật
vật 4.1. Pha chế hĩa chất Chuẩn bị hĩa chất 2,4,6-tripyridyl-s-triazine (TPTZ) FeSO4.7H2O FeCl3.6H2O CH3COONa, CH3COOH Pha chế hĩa chất • Dung dịch đệm acetate: 300 mM, pH=3,6 1,886 g CH3COONa
16 ml dung dịch acid acetic 99,5% Định mức đến 1 lít bằng nước cất Kiểm tra pH, bảo quản lạnh • Dung dịch HCl lỗng: 40 mM
3,38 ml dung dịch HCl đậm đặc 37% (11,8 N) Định mức đến 1 lít bằng nước cất
Bảo quản ở nhiệt độ phịng
• TPTZ(2,4,6-tri[2-pyridyl]-s-triazine): 10 mM 0,031 g TPTZ trong 10 ml dung dịch HCl 40mM Dung dịch này được chuẩn bị hàng ngày.
• FeCl3: 20mM
0,0415 g FeCl3.6H2O
Hịa tan trong 10 ml nước cất • Dung dịch chuẩn
Chuẩn bị dung dịch 1 mM
0,278 g FeSO4.7H2O trong 1 lít nước cất
Từ dung dịch chuẩn 1mM này, pha lỗng 5 lần dùng để xây dựng đường chuẩn
• Chuẩn bị tác nhân FRAP
200 ml đệm acetate 20 ml TPTZ
24 ml nước cất
Chuẩn bị hàng ngày, bảo quản lạnh khi chưa sử dụng.
4.2. Cách thức tiến hành
Sau thời gian trích ly, đem các dịch trích đi ly tâm lạnh ở 4000 vịng trong thời gian 15 phút. Mục đích của ly tâm lạnh là tăng cường khả năng kết lắng của các tạp chất và giảm độ bay hơi cho dung mơi để kết quả đo đạt được chính xác. Sau khi ly tâm, dùng micripipette hút 1ml dịch trích cho vào ống nghiệm, tiến hành pha lỗng dịch trích trong nước đến nồng độ thích hợp.
Sau khi pha lỗng, dùng micropipette hút 1ml dịch trích cho vào ống nghiệm, thêm vào đĩ 2 ml tác nhân FRAP + 2ml nước cất. Để hỗn hợp phản ứng trong 1h rồi đem đi đo độ hấp thu ở bước sĩng 593nm.
Chuẩn bị mẫu trắng: mẫu trắng chỉ chứa 2ml tác nhân FRAP + 3ml nước cất.
Chuẩn bị mẫu đối chứng(control): mẫu đối chứng được chuẩn bị như mẫu thí
nghiệm nhưng thay 1ml mẫu thí nghiệm bằng 1ml dung mơi. Chú ý rằng, nếu dịch trích pha lỗng trong nước bao nhiêu lần thì dung mơi cũng phải pha lỗng trong nước bấy nhiêu lần, nghĩa là hệ số pha lỗng của dung mơi phải bằng hệ số pha lỗng của dịch trích.
Đối với các dịch trích trong dung mơi diethyl ether là quá trình chuẩn bị khác đi một ít. Dịch trích này được pha lỗng trong diethyl ether đến nồng độ thích hợp rồi hút 1ml dịch trích này cho vào ống nghiệm, thêm vào 2ml tác nhân FRAP, lắc mạnh, rồi thêm vào 2ml dung mơi diethyl ether. Để hỗn hợp phản ứng trong 1h rồi đem đi đo quang phổ. Mẫu đối chứng gồm 1ml diethyl ether + 2ml tác nhân FRAP + 2ml nước cất.
Bảng 3: Phương pháp lấy mẫu đo quang phổ ở bước sĩng λ = 593nm.
STT Mẫu
trắng 1 2 3 4 5 6 Mẫu1 Mẫu2 Mẫuđối chứn g Vchuẩn(ml) 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Vmẫu(ml) 1 1 Vdung mơi(ml) 1 VH2O(ml) 3 2,9 2,8 2,6 2,4 2,2 2 2 2 2 VFRAP(ml) 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 OD (593 nm) 4.3. Cơng thức tính
Từ kết quả đo dung dịch chuẩn, dựng đường chuẩn Fe2+ y= f(x) với y là mật độ quang, x là nồng độ Fe2+ (mmol Fe2+/L). Tính độ lệch chuẩn R2 của đường chuẩn. Dựa vào đường chuẩn, tính nồng độ Fe2+ trong mẫu đo quang học M (mmol Fe2+/L). Hoạt tính chống oxi hĩa trong nguyên liệu được tính như sau:
) 100 .( 100 . 1000 . . W m V f M AA − =
AA: hoạt tính chống oxi hĩa trong nguyên liệu (mmol Fe2+/g chất khơ) M: nồng độ Fe2+ trong mẫu đo quang học = hoạt tính chống oxi hĩa trong mẫu đo quang học (mmol Fe2+/L)
f: hệ số pha lỗng
V: thể tích dung mơi dùng trích ly chất chống oxi hĩa (ml) m: khối lượng mẫu đem trích ly (g)
W: độ ẩm mẫu (%).
Chú ý: Khi trích ly, khơng thể nào tồn bộ các chất chống oxi đều đi vào dung mơi. Vì thế, cơng thức trên khơng xác định giá trị thực sự hoạt tính chống oxi hĩa trong nguyên liệu mà chỉ là gần đúng.