c. Vacxin virus đậu gà tái tổ hợp
3.4.Phương pháp xử lý kháng nguyên hồng cầu gắn virus
Lấy máu:
Máu ngan được lấy ở tĩnh mạch cánh (hoặc lấy nửa đầu khi cắt tiết) trộn ngay với dung dịch Alsever theo tỉ lệ 1: 1, dung dịch này vừa có tác dụng chống đơng vừa bão dưỡng hồng cầu. Rửa hồng cầu 3 lần bằng dung dịch muối sinh lý đệm phốt phát PBS pH 7,2 với sự hỗ trợ của máy li tâm ở tốc độ 2500 vòng/phút trong 5 phút. Sau khi rửa lần cuối, pha hồng cầu trong PBS pH 7,2 để có huyễn dịch hồng cầu 50%.
Lasota hố hồng cầu:
Virus (vacxin) Lasota được sử dụng để loại bỏ thụ thể bề mặt hồng cầu ngan. Việc xử lý này làm mất thụ thể gây ngưng kết với virus cúm (cũng như với virus Newcastle) nhờ trên bề mặt virus Lasota có protein bề mặt có hai chức năng gây ngưng kết hồng cầu và sau đó cắt đứt Neuraminic acid bề mặt gây mất ngưng kết hồng cầu. Thông thường, phản ứng mất ngưng kết xuất hiện sau khoảng 2 giờ.
Để xác định lượng virus Lasota thích hợp, trước hết hiệu giá ngưng kết hồng cầu (HA) của virus Lasota được xác định với 50 µl huyền dịch 1% hồng cầu ngan nguyên liệu (Phạm Hồng Sơn & Bùi Quang Anh, 2006). Hiệu giá HA của virus Lasota được sử dụng để tính lượng vacxin cần thiết để làm sạch thụ thể bề mặt toàn bộ khối lượng hồng cầu chuẩn bị xử lý thành giá thể kháng nguyên. Cơng thức tính lượng tối thiểu virus Lasota để gây ngưng kết và làm sạch thụ thể hồng cầu là V = T(M/m) trong đó T là hiệu giá (số thập phân có tử số bằng 1) của virus Lasota cần dùng, V là thể tích (tính bằng ml) dịch Lasota gốc cần dùng, M là khối lượng hồng cầu cần xử lý (đo bằng gam), m là khối lượng (gam) hồng cầu phản ứng trong mỗi lỗ khay (bằng 0,05*0,01). V = 2TM103 là công thức được sử dụng trong trường hợp
trắc định cụ thể nêu trên. Sử dụng liều gấp đơi lượng tối thiểu đó để xử lý lượng hồng cầu nguyên liệu. Hồng cầu ngan (huyền dịch 20% trong PBS) được trộn với virus Lasota trong bình tam giác, khuấy từ tính và để ở nhiệt độ phịng 5 - 6 giờ hoặc qua đêm. Rửa hồng cầu bằng cách đổ bớt nước mặt, thêm nước sinh lý, san ra các ống và quay ly tâm ở 2000 vòng/phút trong 5 phút. Đổ bỏ nước mặt, thêm nước sinh lý mới, khuấy đều và lặp lại việc rửa hồng cầu 2 - 3 lần. Lấy một lượng nhỏ hồng cầu pha thành huyền dịch 1% và thực hiện phản ứng ngưng kết với virus cúm cũng như virus Lasota. Hồng cầu đạt tiêu chuẩn phải không có dấu hiệu dung huyết, chìm tự nhiên trong lỗ khay chứa dung dịch PBS và không ngưng kết với virus cúm cũng như virus Lasota.
Xử lý hồng cầu bằng formalin:
Làm ổn định bề mặt hồng cầu bằng cách trộn huyễn dịch hồng cầu 50% nói trên với một lượng tương đương dung dịch formalin 20% pH7,2 (formalin 40% được pha với một lượng tương đương dung dịch PBS pH 7,2) đậy nắp ống nghiệm để ở nhiệt độ phịng trong 1 giờ, có lắc thường xuyên. Sau đó rửa huyền dịch hồng cầu 3 lần trong PBS hoặc nước sinh lý pH 7,2 (sau khi xử lý formalin huyễn dịch hồng cầu 50% có thể bảo quản được 4 tháng ở nhiệt độ 1 – 4 oC) (Phạm Hồng Sơn, 2004).
Tannin hoá hồng cầu:
Pha hồng cầu thành huyễn dịch 3% trong PBS pH 6,4 rồi thêm vào đó một lượng tương đương axit tannic 1/20000 lắc nhẹ thường xuyên để tăng sự tiếp xúc giữa các thành phần trong 15 phút ở nhiệt độ phòng rồi rửa lại 3 lần bằng dung dịch PBS pH 7,2 sau đó pha thành huyễn dịch hồng cầu 50% trong PBS pH 6,4.
Xử lý hồng cầu bằng virus:
Trước khi virus hóa cần phải xác định lượng virus thích hợp cần gắn lên bề mặt hồng cầu. Lượng kháng nguyên này nếu quá thấp sẽ không gây ngưng kết chắc chắn với kháng thể, ngược lại, nếu quá cao thì một mặt giá thành sẽ cao và mặt khác độ nhạy của phản ứng bị giảm do cần lượng kháng thể lớn để có ngưng kết vững chắc. Bằng phản ứng thực nghiệm chúng tơi xác định được
lượng kháng ngun thích hợp để gắn lên hồng cầu (đã loại bỏ thụ thể) bằng khoảng 20 – 30% lượng kháng nguyên đủ gây ngưng kết tự nhiên với lượng hồng cầu đó (khi chưa loại bỏ thụ thể). Thể tích dịch kháng nguyên virus cúm nguyên liệu cần thiết để phủ hồng cầu phụ thuộc vào hiệu giá của virus H5N1
Bảng xác định dung lượng dịch kháng ngun virus (tính bằng µl) với các hiệu giá khác nhau có thể sử dụng để có các mức độ che phủ bề mặt hồng
cầu khác nhau sử dụng làm kháng nguyên ngưng kết gián tiếp
Nếu hiệu giá (với 50 µl hồng
cầu 1%) virus nguyên liệu
Mức độ che phủ diện tích bề mặt hồng cầu thể mang và lượng hồng cầu tương ứng tính theo hiệu giá ngưng kết để
gắn lên 1 gam hồng cầu
Log2 Số đơn vị HA quy tính 2,5% 5% ~20% ~33% ~50% 100% 50 HA/g 100 HA/g 400 HA/g 700 HA/g 1000 HA/g 2000 HA/g 3 8 300 600 2400 4200 6000 12000 4 16 150 300 1200 2100 3000 6000 5 32 75 150 600 1050 1500 3000 6 64 37,5 75 300 525 750 1500 7 128 18,8 37,5 15 262,5 375 750 8 256 9,4 18,8 7,5 132 188 375 9 512 4,7 9,4 3,8 66 94 188 10 1024 2,3 4,7 1,9 33 47 94
Virus hoá hồng cầu bằng cách trộn huyễn dịch hồng cầu 1,5% đã được tannin hoá với lượng virus đã được tính tốn. Để ở 37 oC trên máy lắc với tốc
độ thấp trong vòng 180 phút, rồi rửa lại bằng dung dịch PBS pH 7,2. Sau khi rửa lại lần cuối, cân lại ống nghiệm để xác định lại khối lượng hồng cầu. Pha hồng cầu với dung dịch PBS pH 7,2 để có huyễn dịch 1%, như vậy ta có kháng nguyên hồng cầu gắn virus hay kháng nguyên ngưng kết hồng cầu gián tiếp (kháng nguyên IHA). Kiểm tra độ sa lắng của hồng cầu trong dung dịch PBS ở các lỗ khay vi chuẩn độ 96 lỗ.
Pha hồng cầu đã gắn kháng nguyên virus (kháng nguyên IHA) với dung dịch PBS pH 7,2 để có huyền dịch 1%. Dùng huyền dịch hồng cầu này kiểm tra hiệu giá của kháng thể (γ-globulin nguyên liệu chế từ kháng huyết thanh chống cúm) với khay vi chuẩn độ 96 lỗ và pha kháng thể chuẩn có nồng độ 4log2, rót ống 0,5 ml bảo quản lạnh sâu -20 oC, cho giải đông chậm trên nước lạnh trước khi làm phản ứng. Kháng nguyên IHA được quay li tâm loại bỏ nước mặt và pha lại bằng dung dịch chống hóa băng (CHB) để có huyền dịch 10%. Trộn đều và cho mỗi 0,5 ml huyền dịch kháng nguyên này vào các ống loại cỡ 10 ml. Bảo quản cũng ở -20 oC, trước khi dùng lấy ra để ở nhiệt độ phòng. Các ống kháng nguyên hồng cầu, γ-globulin, một ống chứa 10 ml dung dịch PBS và một ống chứa 0,05 ml dịch kháng nguyên âm tính (niêm dịch) tạo thành một kit IHI chẩn đoán bệnh cúm A.
Trước khi thực hiện phản ứng, γ-globulin chuẩn được giải đơng ở nhiệt độ phịng. Kháng ngun IHA được pha thêm 5 ml PBS để có 5,5 ml (1%) dư cho một khay phản ứng 96 lỗ. Sau khi hồn ngun có thể bảo quản huyền dịch này trên nước đá hoặc tủ lạnh 4 oC được 5 ngày.
Lưu ý: trong quá trình bảo quản kháng nguyên hồng cầu cần thêm một lượng formalin để đạt nồng độ formaldehyd 4/1000 để chống nhiễm khuẩn và nấm.