c. Vacxin virus đậu gà tái tổ hợp
3.5. Xác định hiệu giá kháng thể chuẩn bằng phản ứng IHA
Để tiến hành được phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gián tiếp (IHI), cần một lượng huyết thanh chuẩn hoặc γ-globulin co hiệu giá không đổi đạt 4log2 hoặc 5log2.
Ngun lí: Bình thường virus H5N1 khơng hấp thụ lên bề mặt hồng cầu, do đó phải xử lí hồng cầu bằng axit tanic 1/20000. Chất này có một nhóm chức gắn với hồng cầu và một nhóm chức gắn với virus H5N1, nhờ vậy virus H5N1 dễ dàng hấp thụ lên bề mặt hồng cầu. Khi gặp kháng thể tương ứng virus sẽ kết hợp với kháng thể làm cho hồng cầu dính lại qua các cầu nối kháng nguyên-kháng thể-kháng nguyên gây hiện tượng ngưng kết hồng cầu
(phản ứng IHA). Phản ứng được tiến hành trên khay nhựa vi chuẩn độ (Microtitrate 96 lỗ đáy chữ U hoặc V. Để xác định hiệu giá kháng thể chuẩn một cách chính xác, ta cần làm một lần 3 dãy 12 lỗ và lặp lại thí nghiệm 3 lần. Hiệu giá kháng thể chuẩn đạt được ở cả 3 dãy lỗ và trong 3 lần thí nghiệm phải đồng đều thì kháng thể mới được coi là có hiệu giá ổn định.
Đầu tiên cho vào tất cả các lỗ 50 µl dung dịch sinh lý hoặc dung dịch PBS có pH 7,2; sau đó cho vào lỗ thứ nhất 50 µl huyết thanh cần chuẩn. Trộn đều bằng cách hút nhả 3 – 4 lần rồi hút 50 µl sang lỗ thứ 2, lại trộn đều rồi hút 50 µl sang lỗ thứ 3 và tiếp tục thao tác cho đến lỗ thứ 11 thì hút bỏ 50 µl. Lỗ thứ 12 dùng để làm đối chứng âm tính bằng cách thay huyết thanh bằng nước sinh lý hoặc PBS có pH 7,2. Sau đó thêm vào tất cả các lỗ 50 µl kháng nguyên hồng cầu 1% (huyễn dịch hồng cầu được khuấy đảo đều thường xuyên tránh sự sa lắng hồng cầu để có huyễn dịch hồng cầu đồng nhất cho tất cả các lỗ khay làm thí nghiệm). Đậy kín khay tránh hiện tượng bốc hơi nước, để ở nhiệt độ phòng 30 phút, đọc kết quả khi hồng cầu ở lỗ đối chứng âm (lỗ thứ 12) đã sa lắng hoàn toàn và tập trung gọn ở đáy lỗ. Hiệu giá kháng thể là độ pha loãng cao nhất của huyết thanh mà ở đó cịn có hiện tượng ngưng kết.