c. Vacxin virus đậu gà tái tổ hợp
3.3.3. Phương pháp chế γ-globulin
Kết tủa kháng thể và hoàn dạng dung dịch
Kết tủa kháng thể được thực hiện ở nhiệt độ phòng bằng cách pha dần một thể tích dung dịch (NH4)2SO4 bão hịa vào hai thể tích huyết thanh đã làm lạnh. Trong quá trình thêm (NH4)2SO4, huyết thanh cần được khuấy thường xuyên và chú ý duy trì lạnh tránh sự phân giải protein.
Quay ly tâm 15 phút ở tốc độ 1500 vòng/phút. Lấy ống ra đổ bỏ hết nước mặt, dốc ngược ống trên khăn giấy cho hết phần dịch dính quanh miệng ống nghiệm. Thêm nước cất cho đủ lượng ban đầu của huyết thanh rồi khuấy kỹ để hòa tan tủa.
Thêm một lượng dung dịch (NH4)2SO4 bão hòa như đối với huyết thanh ban đầu. Lặp lại việc kết tủa và hồn dạng dịch 3 lần, lần cuối có thể giảm bớt lượng nước dùng pha tủa nhằm thu được dung dịch γ-globulin có độ đậm đặc cao mà sau đó có thể điều chỉnh nồng độ mong muốn bằng cách pha thêm nước.
Chuẩn độ lượng (NH4)2SO4 lưu lại trong dung dịch γ-globulin
Sau khi hoàn dạng, dung dịch γ-globulin chứa một lượng (NH4)2SO4 cần phải loại bỏ bằng một lượng vừa đủ BaCl2.2H2O tinh khiết. Tuy nhiên, (NH4)2SO4 tồn lưu với nồng độ cao hay thấp là không xác định và phụ thuộc vào lượng protein huyết thanh và lượng nước pha thêm. Lượng khá lớn (NH4)2SO4 đã được rót bỏ theo nước mặt là khơng xác định nên cần phải chuẩn độ hàm lượng chất này lưu lại trong dung dịch. Việc chuẩn độ này được thực hiện bằng dung dịch BaCl2 1N qua hai mức khác nhau, theo các bước sau đây:
* Chuẩn độ mức 1:
Lấy sẵn một dãy ống Eppendorf (loại 1,5ml, chừng 5 – 10 ống, tùy nồng độ (NH4)2SO4 cịn sót), cho vào mỗi ống 0,5ml nước cất. Cho vào ống thứ nhất 0,5 ml dung dịch γ-globulin cần thử, trộn đều rồi chuyển 0,5ml sang ống Eppendorf thứ hai, trộn đều rồi chuyển như vậy qua ống tiếp theo và tiếp tục trộn - chuyển cho đến hết dãy ống. Ta thu được dãy dung dịch pha loãng theo cấp số 2.
Dùng pipet cho vào mỗi ống trong dãy 0,05ml dung dịch BaCl2 1N. Chú ý các pipet tự động có thể có dung tích khơng đúng như chỉ số hiển thị, vì vậy nên chọn cặp pipet có độ chính xác đáng tin cậy. Trộn đều bằng cách hút vào pipet vài lần, để ở nhiệt độ phịng để cho kết tủa hình thành và lắng xuống đến lúc ổn định. Xác định cặp ống Eppendorf kế tiếp nhau có hàm lượng kết tủa thay đổi (ống sau có độ pha lỗng giới hạn dưới có kết tủa ít hơn ống trước có độ pha loãng giới hạn trên). Ghi lại độ pha loãng (của dung dịch γ-globulin thơ cịn chứa (NH4)2SO4 giới hạn trên, ký hiệu T). Tính lượng tối thiểu BaCl2.2H2O tinh thể (tính bằng mol/lít) cần thêm để trung hịa (NH4)2SO4 trong một lít dung dịch γ-globulin bằng cơng thức:
a = ½T.10-1/(p-0,05) = 0,05T/(p-0,05)
(Trong đó T là độ pha lỗng giới hạn trên, T = 2, 4, 8,...; ½ là tỷ lệ giữa khối lượng BaCl2 1N và 1M; 10-1 là tỷ lệ giữa thể tích dung dịch BaCl2 chuẩn độ và thể tích dung dịch mẫu chứa (NH4)2SO4, p là hệ số hiệu chỉnh (0,5< p <1) và được xác định bằng chuẩn độ mức 2 dưới đây; 0,05 là giá trị hiệu chỉnh trung gian giữa tỷ suất nồng độ giới hạn trên mức 2 và tỷ suất nồng độ kế tiếp cũng ở bước chuẩn độ mức 2 dưới đây).
Thay thế đại lượng mol của BaCl2.2H2O bằng khối lượng 224 gam ta có cơng thức:
a = 112.T.10-1/(p-0,05) = 11,2T/(p-0,05) (gam/lít).
* Chuẩn độ mức 2:
Để xác định hệ số hiệu chỉnh p trong cơng thức tính lượng BaCl2 tinh thể cần bổ sung nêu trên ta cần chuẩn độ mức 2 theo các bước sau:
Lấy một lượng nhỏ dung dịch γ-globulin cần chế vừa đủ và pha thêm nước để có khoảng 2,5 ml dung dịch γ-globulin có nồng độ (NH4)2SO4 giới hạn trên (nồng độ T). Lấy sẵn một dãy 6 ống Eppendorf, cho vào lần lượt 0,5; 0,45; 0,4; 0,35; 0,3 và 0,25 ml dung dịch γ-globulin nồng độ (NH4)2SO4 ở giới hạn trên. Thêm nước cho đủ 0,5 ml ở mỗi ống. Ống đầu tiên có nồng độ (NH4)2SO4 ở giới hạn trên, ống cuối cùng có nồng độ giới hạn dưới, như vậy các ống có tỷ suất nồng độ tương ứng là 1; 0,9; 0,8; 0,7; 0,6; và 0,5 so với điểm giới hạn trên. Thêm 0,05 ml dung dịch BaCl2 1N vào tất cả các ống, trộn đều, để cho kết tủa ổn định, xác định điểm giới hạn trên của chuẩn độ mức 2. Hệ số hiệu chỉnh p là tỷ suất nồng độ dung dịch globulin chứa (NH4)2SO4 của ống thử ở điểm giới hạn trên của chuẩn độ mức 2 so với điểm giới hạn trên của bước chuẩn độ mức 1 (tức là p sẽ là một trong các giá trị 1; 0,9; 0,8; 0,7 và 0,6 tương ứng ống giới hạn trên mới).
Trung hòa (NH4)2SO4 bằng BaCl2
Dùng BaCl2.2H2O tinh thể vừa đủ cho vào dung dịch γ-globulin thô để trung hịa (NH4)2SO4. Lượng này tính được sau khi thế đủ các giá trị T và p vào công thức a = 11,2T/(p-0,05) (gam/lít) nêu trên. Cân BaCl2.2H2O tinh thể
và hịa dần từng phần nhỏ vào dung dịch γ-globulin thô (giữ lạnh) và khuấy đều. Chờ kết tủa hình thành hồn tồn và lắng xuống, quay li tâm, rót nước mặt sang ống khác ta có dung dịch γ-globulin cần chế. Để ống nghiệm trong nước đá.
Kiểm tra lượng BaCl2 dư bằng cách cho 0,5 ml dung dịch γ-globulin chế được vào một ống Eppendorf, nhỏ vào đó một số giọt NaHCO3 (hoặc K2CO3) 1N. Dung dịch γ-globulin tinh chế không xuất hiện kết tủa với thử nghiệm này. Kết tủa xuất hiện có thể do các chỉ số của pipet đã sử dụng không đúng với dung tích thực. Nếu có kết tủa xuất hiện khơng phải vì lý do này thì do sự sai khác giữa nồng độ thực và nồng độ xác định qua công thức trên với giá trị hiệu chỉnh trung gian 0,05. Khi đó, có thể bổ sung dần một lượng nhỏ NaHCO3 tinh thể (không vượt quá một nửa khoảng cách giữa điểm giới hạn trên và điểm giới hạn dưới của chuẩn độ mức 2, tức < 0,5{[0,05T/p]-[0,05T/(p-0,05)]} hay < 0,025T/(20p-1), tính theo mol/lít), trộn đều rồi quay li tâm để loại bỏ tủa BaCO3. Cần lưu ý rằng hàm lượng nhỏ (NH4)2SO4 cịn sót, như trong trường hợp chế bằng phương pháp thẩm tích, có thể khơng ảnh hưởng lớn, trong khi BaCl2 dư sẽ kết tủa trong dung dịch PBS trung tính và kiềm, cịn NaHCO3 (hoặc K2CO3) có thể làm tăng pH của dung dịch γ-globulin (có thể trung hịa bằng HCl nhưng sẽ tăng áp suất thẩm thấu, dung lượng và tỷ trọng của dung dịch), và đều gây trở ngại cho phản ứng huyết thanh học, vì vậy nên tính vừa đủ, tránh dùng thừa BaCl2 trong bước loại bỏ (NH4)2SO4.
Kiểm định tính đặc hiệu của γ-globulin thu được từ kháng huyết thanh
Tính đặc hiệu của sản phẩm được kiểm định bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp (IHA). Hồng cầu ngan được xử lý bằng lượng dư enzyme để phân giải thụ thể bề mặt và được kiểm tra lại bằng phản ứng ngưng kết với kháng nguyên virut cúm A .Hồng cầu mất tính ngưng kết tự nhiên được coi là sạch và được xử lý lần lượt bằng formalin và tanin rồi gắn một trong số các kháng nguyên virut cúm A(H5N1), Newcastle (Lasota), dịch tả lợn, lở mồm long móng typ A, và lở mồm long móng typ O. Các kháng huyết thanh đặc
hiệu với các virut tương ứng nêu trên được chế bằng tối miễn dịch thỏ trưởng thành và được điều chế γ-globulin bằng phương pháp hóa học nêu trên. Các phản ứng ngưng kết gián tiếp đồng loại và dị loại (phản ứng chéo) giữa hồng cầu gắn kháng nguyên virus với các loại γ-globulin được thực hiện trên khay 96 lỗ (Phạm Hồng Sơn, 2004b) với 5 mẫu với mỗi cặp yếu tố phản ứng.