2.3.2.1. Gây mô hình bệnh TTPL trên chuột
Ketamine được pha với dung dịch NaCl 0,9% tiêm vào màng bụng chuột liều 20 mg/kg, ngày tiêm 1 lần vào lúc 15h, trong 14 ngày liên tục.
2.3.2.2. Gây mô hình bệnh TTPL trên khỉ
- Thí nghiệm 1: đánh giá ảnh hưởng của PCP và MAP lên hành vi của khỉ
Khỉ thuộc nhóm PCP được tiêm trường diễn PCP với liều 0,3mg/kg /ngày trong thời gian hơn 7 tháng (tiêm bắp thịt). Khỉ thuộc nhóm này đôi khi cũng
được tiêm thêm MAP với liều 2.0mg/kg (tiêm bắp thịt) chỉ trong ngày kiểm tra hành vi. Khỉ thuộc nhóm đối chứng cũng nhận một lượng tương ứng nước muối sinh lý. MAP và PCP được hòa tan ngay trước khi tiêm trong nước muối sinh lý 0,9%, PCP được tiêm hằng ngày và buổi chiều lúc 16 giờ và MAP được tiêm vào buổi sáng 45 phút trước khi kiểm tra hành vi. Sau bảy tháng sử dụng PCP hành vi của khỉ sẽđược phân tích.
- Thí nghiệm 2: đánh giá ảnh hưởng của ketamine lên hành vi của khỉ
Khỉ thuộc nhóm PCP được tiêm ketamine với liều 0,3mg/kg /ngày trong thời gian 14 ngày (tiêm bắp thịt). Vận động cá nhân của khỉ sẽ được phân tích trước, trong và sau tiêm thuốc. Hành vi xã hội của khỉ sẽ được phân tích trước, và sau tiêm thuốc.
2.3.2.3. Phương pháp đánh giá tác dụng của thuốc trên mô hình TTPL
Quy trình nghiên cứu được mô tả như dưới đây:
Chuột gồm 80 chuột được chia thành 8 lô (10 con/ lô). Trước khi uống thuốc chuột bị bỏđói trong 12 giờ. Chuột được cho uống cao lỏng tiêu dao tán –
địch đàm thang (tỷ lệ 3:1) liều tăng dần từ 0,02 đến 0,16 ml/g trọng lượng cơ thể
(TLCT). Trong số các mức liều đem thử, khoảng cách giữa mức liều cao nhất chưa gây chết một con chuột nào và mức liều thấp nhất gây chết 100% số chuột trong nhóm được sử dụng để tính toán. Sau dùng thuốc, chuột được nuôi dưỡng và theo dõi, nước uống tự do. Thời gian theo dõi tình trạng chuột và tỷ lệ sống chết ở mỗi lô trong 72 giờ sau uống thuốc. Số chuột chết được đếm theo nhóm và phẫu thuật
* Nước muối sinh lý 0,9%:
Tiêm NaCl 0,9% vào màng bụng chuột liều 0,01ml/g TLCT/ ngày, ngày tiêm 1 lần vào 9 giờ sáng, trong 14 ngày liên tiếp
* Thuốc ketamine
- Pha thuốc ketamine: ketamine lọ 10ml hàm lượng 50mg/ ml được pha với dung dịch NaCl 0,9% (tỷ lệ 1:24).
- Tiêm thuốc ketamine: tiêm ketamine vào màng bụng chuột với liều 20mg/kg TLCT/ngày, ngày tiêm 1 lần vào 9 giờ sáng, trong 14 ngày liên tục.
* Thuốc Clozapine:
- Pha thuốc clozapine: clozapine viên 100mg pha với dung dịch nước cất tỷ lệ 100mg + 50ml nước cất.
- Uống thuốc clozapine: cho chuột uống clozapine liều 5ml/kg TLCT/ngày (10mg/kg/ngày), uống 1 lần/ngày vào 10 giờ sáng trong 30 ngày tiên tiếp.
* Thuốc đông y:
Thuốc đông y gồm các vị thuốc trong bài Tiêu dao tán – Địch đàm thang,
được sắc dạng cao lỏng, tỷ lệ 3:1. Cho chuột uống với liều 0,02ml/g TLCT/ngày (tương đương 0,06mg/g TLCT/ngày). Uống 1 lần/ngày lúc 10 giờ sáng, liên tục trong 30 ngày.
* Thuốc Haloperidol:
Tiêm Haloperidol (đã pha) vào màng bụng chuột liều 1mg/ kg, ngày tiêm 1 lần vào lúc 15h, trong 7 ngày liên tục.
2.3.2.4. Quy trình đánh giá tác dụng của thuốc trên mô hình TTPL
* Quy trình nhóm Chứng
- Lần 1: Vận động, giao tiếp, chữ thập ghi 3 ngày liên tiếp - Lần 2: + Vận động, giao tiếp, chữ thập ghi 3 ngày liên tiếp + Mê lộ nước ghi 7 ngày liên tiếp
+ Mê lộ thức ăn: tập, ghi 7 ngày liên tiếp
* Quy trình nhóm tiêm Ketamin sau tiêm 14 ngày
- Lần 1: Vận động, giao tiếp, chữ thập ghi 3 ngày liên tiếp. - Lần 2: + Vận động, giao tiếp, chữ thập ghi 3 ngày liên tiếp. + Mê lộ nước ghi 7 ngày liên tiếp.
+ Mê lộ thức ăn: tập, ghi 7 ngày liên tiếp.
Ghi, phân tích hành vi lần 1 Tiêm NaCl 0,9% (0,01 ml/g/ng) 14 1 21 Ghi, phân tích hành vi lần 2 Ngày 22 28 15 Ghi, phân tích hành vi lần 1 Tiêm ketamin (20mg/kg) 14 1 21 Ghi, phân tích hành vi lần 2 Ngày 15 17 22 28 17
* Quy trình nhóm tiêm Haloperidol
- Lần 1: Vận động, giao tiếp, chữ thập ghi 3 ngày liên tiếp. - Lần 2: Vận động, giao tiếp, chữ thập ghi 1 ngày.
- Lần 3: Vận động, giao tiếp, chữ thập ghi sau tiêm Haloperidol 30 phút. - Lần 4: + Vận động, giao tiếp, chữ thập ghi 3 ngày liên tiếp.
+ Mê lộ nước ghi 7 ngày liên tiếp.
+ Mê lộ thức ăn: tập, ghi 7 ngày liên tiếp.
* Quy trình nhóm ketamine sau tiêm ngày thứ 21
- Lần 1: Vận động, giao tiếp, chữ thập ghi 3 ngày liên tiếp. - Lần 2: Vận động, giao tiếp, chữ thập ghi 1 ngày.
- Lần 3: Vận động, giao tiếp, chữ thập ghi ghi 3 ngày liên tiếp.
* Xác định độc tính trên gan, thận, máu sau uống thuốc đông y:
Tiêm Keta (20 mg/kg/ng) 15 16 Không tiêm 22 1 Ghi, phân tích hành vi lần 2 Ghi, phân tích hành vi lần 1 29 Ghi, phân tích hành vi lần 3 Ngày 14 Tiêm Keta (20 mg/kg/ng) 15 16 Tiêm Hal (1mg/kg/ng) 22 1 Ghi, phân tích hành vi lần 2 Ghi, phân tích hành vi lần 3 Ghi, phân tích hành vi lần 1 29 Ghi, phân tích hành vi lần 4 Ngày 36 30 14 23
* Quy trình nhóm TDT:
* Quy trình nhóm clozapine:
Đối với nhóm TDT và nhóm clozapine:
- Ghi và phân tích lần 1, 2, 3: ghi hoạt động của chuột trong buồng giao tiếp, buồng vận động, ghi trong 3 ngày liên tiếp.
- Ghi và phân tích lần 4:
+ Ghi hoạt động của chuột trong buồng giao tiếp, buồng vận động, ghi trong 3 ngày liên tiếp
1 30 Trước uống thuốc Sau uống thuốc Xét nghiệm lần 1 Xét nghiệm lần 2 Tiêm ketamin Ghi, phân tích lần 2 Uống đông y liều 0,02ml/g TLCT/ngày Ghi, phân tích lần 3 Ghi, phân tích lần 1 3 4 17 18 28 38 47 48 61 Ghi, phân tích lần 4 Ngày Uống đông y liều 0,02ml/g TLCT Ngày 1 Tiêm ketamin Ghi, phân tích lần 2 Uống clozapine liều 10ml/g TLCT/ngày Ghi, phân tích lần 3 Ghi, phân tích lần 1 3 4 17 18 28 38 47 48 61 Ghi, phân tích lần 4 Ngày 1
+ Ghi hoạt động của chuột trong mê lộ nước, ghi 7 ngày liên tiếp
+ Ghi hoạt động của chuột trong mê lộ thức ăn: bỏđói 1 đêm, ghi trong 7 ngày liên tiếp
2.3.2.4. Phương pháp đánh giá mô hình bệnh TTPL trên chuột * Đánh giá chức năng vận động:
Trong bài tập này hai chuột được cho vào buồng ghi đánh giá hành vi tương tác xã hội. Chuột được cho vào buồng lớn gọi là chuột phân tích, chuột còn lại chưa được tiêm thuốc, cùng giới được cho vào buồng nhỏ gọi là chuột
đối tác.
Hai chuột có 10 phút để làm quen với chuồng ghi. Sau đó tất cả hành vi của chuột sẽ được ghi lại bằng CCD camera với độ phân giải cao và dữ liệu
được lưu giữ dưới dạng file video trong ổ cứng của máy tính. Thời gian ghi cho mỗi chuột là 10 phút/1 ngày.
Hành vi tương tác xã hội giữa hai chuột được tính khi hai chuột tương tác, lại gần nhau và các hành vi cụ thể như: ngửi, đè lên nhau , bới lông cho nhau.
Các thông số này đựợc tính toán tựđộng bằng sử dụng phần mềm ANY- maze của Mỹ
* Đánh giá hành vi tương tác xã hội:
Trong bài tập này 2 chuột được cho vào buồng ghi đánh giá hành vi xã hội. Chuột phân tích là chuột ở trong buồng lớn, chuột đối tác là chuột ở trong buồng nhỏđặt ở phía trong buồng lớn.
Hai chuột có 10 phút để làm quen với buồng ghi. Sau đó hành vi của chuột sẽ được ghi lại bằng CCD camera với độ phân giải cao và dữ liệu được lưu giữ dưới dạng file video trong ổ cứng của máy tính. Thời gian ghi cho mỗi chuột là 10 phút/1 ngày, mỗi lần ghi và phân tích hành vi ghi 3 ngày liên tiếp lấy giá trị trung bình. Trong bài tập này hành vi của chuột phân tích được phân tích và đánh giá.
Hành vi tương tác xã hội của chuột được tính khi 2 chuột tương tác, lại gần nhau, có các hành vi ngửi, chạm vào nhau…
* Đánh giá hành vi vận động khám phá, tìm hiểu môi trường mới và cảm xúc:
Chuột được cho vào trong mê lộ hình chữ thập trong vòng 15 phút để làm quen. Sau đó tất cả hành vi của chuột sẽ được ghi lại bằng CCD camera với độ
phân giải cao và dữ liệu được lưu giữ dưới dạng file video trong ổ cứng của máy tính. Thời gian ghi cho mỗi chuột là 10 phút/1 ngày, ghi 3 ngày liên tiếp lấy giá trị trung bình.
* Đánh giá khả năng học tập, trí nhớ bằng mê lộ nước và mê lộ thức ăn
- Mê lộ nước:
Chuột cho đợt kiểm định được chia thành các nhóm, mỗi nhóm 4 con, và
đánh số. Chuột cho thích nghi với môi trường khoảng 5 – 10 phút trước kiểm
định.
Cách thức tiến hành:
+ Đặt chuột lên bến đỗ khoảng 30 giây, để chuột tự quan sát môi trường tiếp sau là 3 lần kiểm định (ở 3 góc phần tư không có bến đỗ).
+ Sau đó nhấc chuột lên khỏi bến đỗ và thả theo hướng quay mặt vào thành mê lộ (về phía bến đỗ) ở vị trí giữa của một góc phần tư.
+ Khi chuột tìm được bến đỗ, để chuột tại đó khoảng 5 – 10 giây, rồi lại nhấc ra, đặt vào hộp đựng động vật có khăn thấm nước.
+ Tiếp tục các thao tác này với 3 động vật còn lại.
+ Lặp lại quy trình thả chuột lần 2 ở một góc phần tư bất kỳ. Không thả
lặp lại ở góc vừa thả, và không thảở góc phần tư có bến đỗ.
+ Thời gian cho 1 lần kiểm định là 60 giây. Quá 60 giây chuột chưa tìm
được bến đỗ thì nhấc ra đặt lên bến đỗ 20 giây.
+ Trước mỗi lần thả sau này (lần 2, lần 3), không cần đặt chuột lên bến đỗ
nữa. Nhưng khi chuột tìm được bến đỗ, để chuột tại bến đỗ 5 – 10 giây.
+ Sau 3 lần thả cho mỗi chuột (3 x 4 động vật = 12 lần thả), cho nhóm chuột nghỉ 20 – 30 phút, rồi lặp lại chùm thao tác lần tiếp. Như vậy mỗi chuột
được thả bơi 6 lần.
Hành vi của chuột sẽđược ghi lại bằng CCD camera với độ phân giải cao và dữ liệu được lưu giữ dưới dạng file video trong ổ cứng của máy tính. Thí nghiệm được thực hiện trong 7 ngày liên tiếp, lấy giá trị trung bình theo từng ngày.
- Mê lộ thức ăn:
Chuột cho đợt kiểm định được chia thành các nhóm và đánh số. Chuột cho nhịn đói từ hôm trước.
Cách thức tiến hành:
Đặt chuột vào cửa xuất phát, hướng dẫn chuột tìm đường chạy tới đích để được ăn. Khi đã tới đích để chuột ăn một chút rồi lại cất ngay thức ăn đi.
Cho chuột nghỉ tại ô đích 5 phút rồi tiến hành cho chuột chạy lại từ đầu. Mỗi ngày tập 2 lần, mỗi lần 4 lượt, mỗi lượt cách nhau 5 phút. Tập liên tục 7 ngày liên tiếp.
Tính thời gian từ khi thả chuột vào của xuất phát tới khi tìm được ô đích.
2.3.2.5. Phương pháp nghiên cứu về hành vi xã hội trên khỉđã gây bệnh TTPL
Một chiếc chuồng lớn được tạo bởi 3 chiếc chuồng con nối với nhau được sử dụng để phân tích hành vi của khỉ. Trong chiếc chuồng này có 2 vách ngăn cách chuồng trung tâm và hai chuồng bên, các vách này có thể được dỡ bỏ khi bắt đầu các bài kiểm tra hành vi của khỉ. Đỉnh của chiếc chuồng lớn được bao phủ bởi một miếng nhựa trong suốt mà cho phép việc ghi hành vi của khỉ bằng máy quay CCD đặt ở trên đỉnh của chuồng khỉ. Trước khi kiểm tra hành vi, khỉ được đặt vào hai chuồng bên và có 4 đến 6 lần gặp nhau để làm quen.
Thí nghiệm 1 : mỗi khỉđược đặt vào một chuồng bên, (16 giờ sau khi tiêm PCP với khỉ thuộc nhóm PCP, 45 phút sau khi tiêm MAP với khỉ thuộc nhóm PCP+MAP) và khỉ có 10 phút để làm quen, sau đó 2 vách ngăn được dỡ bỏ
trong vòng 60 phút. Máy quay CCD gắn trên đỉnh của trần nhà gửi tín hiệu hình
ảnh của khỉ tới máy tính và tín hiệu sẽ được phân tích tự động tức thì bởi sử
dụng phần mềm thương mại (PrimateScan và PrimateSocialScan của công ty Clever Sys, Mỹ). Tín hiệu cũng được cất giữ trong ổ cứng của máy tính để phần tích tự động và phân tích kiểm tra bằng mắt thường. Phần mềm phân tích hành vi có thể phát hiện nhiều hơn 15 loại hành vi xã hội và hành vi cá nhân của khỉ
trong chuồng.
Bảng 2.2. Phân loại và định nghĩa hành vi xã hội của khỉ.
1) Grooming: một con khỉ cầm và rẽ lông của con khỉ khác. 2) Mounting: một con khỉ cưỡi lên trên con khỉ khác.
3) Bidirectional approach: cả hai con khỉ tiến lại gần nhau
4) Unidirectional directional approach: một con khỉ tiếp cận một con khỉ khác
5) Leaving: một con khỉ rời xa con khỉ khác. 6) Following: một con khỉ theo sau con khỉ khác.
7) Proximity: khoảng cách giữa hai con khỉ nhỏ hơn 60cm.
Thí nghiệm 2:
+ Vận động cá nhân được ghi lại trước, sau khi tiêm thuốc ketamine 10 phút, sau khi tiêm thuốc ketamine 14 ngày: một khỉ được cho vào buồng lớn, toàn bộ quá trình vận động của khỉ đựợc máy quay CCD gắn trên đỉnh của trần nhà ghi lại gửi tới máy tính và tín hiệu sẽđược ghi lại và phân tích sau đó bởi sử
dụng phần mềm phần mềm thương mại của Mỹ (ANY-maze, của công ty Stoeling, Mỹ). Các thông số về vận động của khỉ bao gồm: quãng đường, vận tốc vận động trung bình của khỉ trong chuồng thí nghiệm (toàn bộ chuồng lớn) và khu vực trung tâm (chuồng nhỏở giữa).
+ Hành vi xã hội của khỉ được ghi lại trước khi tiêm thuốc và sau 14 ngày tiêm thuốc: hai khỉ đôi một được cho vào buồng lớn, toàn bộ quá trình tương tác của khỉ đựợc máy quay CCD gắn trên đỉnh của trần nhà ghi lại gửi tới máy tính và tín hiệu sẽđược ghi lại và phân tích sau đó bởi sử dụng phần mềm phần mềm nguồn mã mở (Kinovea), bằng sự quan sát bởi mắt thường. Các hành vi xã hội trong nghiên cứu này cũng được phân loại và định nghĩa như thí nghiệm 1.
Thí nghiệm 3: Hai khỉ (một khỉ ghi điện tế bào thần kinh và khỉ đối tác)
được đưa vào lồng thí nghiệm được tạo bởi 3 lồng liên kết với nhau. Để ngăn ngừa tiếp xúc trực tiếp giữa các con khỉ ghi điện tế bào thần kinh và khỉ đối tác mà có thể làm hư hỏng hệ thống dây truyền tín hiệu, một tấm lưới sắt được đặt giữa hai khỉ.
Hoạt động thần kinh và hành vi xã hội đã được ghi đồng thời. Các hành vi xã hội được phân tích trực tuyến bằng cách cùng một máy tính và phần mềm phân tích hành vi TopScan (Clever sys, Mỹ) . Máy tính này phân tích dữ liệu từ
chúng đến các máy tính để ghi điện tế bào thần kinh. Hành vi xã hội cũng được phân tích offline bằng cách kiểm tra trực quan bằng mắt thường.
Các loại hành vi xã hội của khỉđược liệt kê ở bảng 2.3.
Bảng 2.3. Phân loại và định nghĩa các hành vi của khỉ mà đã được phân tích.
Hành vi của khi ghi điện tế bào thần kinh Hành vi của khỉ đối tác - Tiếp cận 1 (Approaching1): Khỉ ghi tiếp cận khỉđối tác. - Rời đi 1 (Leaving1): Khỉ ghi rời xa khỉ đối tác.
- Rẽ lông 1 (Groom1): Khỉ ghi rẽ lông và bắt chấy cho bản thân nó
- Chuyển động xung quanh (Moving around1): Khỉ ghi chuyển động qua lại xung quanh khỉđối tác - Tiếp cận 2 (Approaching2): Khỉ đối tác tiếp cận khỉ ghi.