- Ở Việt Nam nghiên cứu TTPL chủ yếu là các nghiên cứu dịch tễ học như nghiên cứu của Bùi Thế Khanh ở 16 xã tại Hà Tây [7], của Ngô Ngọc Tản nghiên cứu khảo sát về nhu cầu sức khỏe tâm thần ở Hà Đông [8]. Một số tác giả khác nghiên cứu về đặc điểm lâm sàng của bệnh TTPL, tập trung vào đặc trưng các triệu chứng chính của bệnh nhưđặc điểm ảo giác trong bệnh tâm thần
phân liệt [9], nghiên cứu đặc điểm lâm sàng và nồng độ dopamin huyết tương ở
bệnh nhân TTPL [2].
- Tuy nhiên hiện tại ở Việt Nam chưa có các nghiên cứu gây mô hình TTPL trên động vật thực nghiệm để nghiên cứu sâu về cơ chế thần kinh, về giải phẫu bệnh lý cũng như nghiên cứu thử nghiệm về dược học để sản xuất thuốc phục vụđiều trị cho bệnh nhân TTPL.
CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Gây mô hình bệnh TTPL và đánh giá hành vi trên chuột
Chuột nhắt trắng, giống đực khỏe mạnh 8-10 tuần tuổi (trọng lượng từ 20- 30 g) với số lượng là 112 chuột, do ban chăn nuôi Học viện Quân y cung cấp. Chuột trước và sau khi tiêm thuốc ketamine được chăm sóc và nuôi trong phòng
đủ thoáng mát, ăn uống đầy đủ, chu kỳ sáng/tối được duy trì 12/12 giờ.
Động vật được chia thành hai lô:
- Lô chứng: gồm 28 chuột được tiêm dung dịch NaCl 0,9% 14 ngày liên tục, đánh giá hành vi trước và sau tiêm.
- Lô ketamine (Keta): gồm 56 chuột được tiêm ketamin 14 ngày liên tục. Sau đó được chia thành 2 nhóm:
+ Nhóm ketamine sau tiêm 14 ngày: gồm 28 chuột, đánh giá hành vi trước và sau khi gây mô hình.
+ Nhóm sau tiêm ketamine ngày thứ 21 (ST 21 ng): gồm 28 chuột, sau khi gây mô hình sẽ không tiêm 7 ngày sau đánh giá lại hành vi.
2.1.2. Gây mô hình TTPL và nghiên cứu về hành vi xã hội trên khỉ
- Thí nghiệm 1: đánh giá ảnh hưởng của PCP và MAP lên hành vi của khỉ
Nghiên cứu sử dụng 6 khỉ sóc lấy từ Trung tâm nuôi dưỡng khỉ Đảo Rều, Quảng Ninh (macaca fuscata, 3 con đực và 3 con cái) cân nặng từ 7 đến 9 kg. Toàn bộ khỉ được chia thành hai nhóm: nhóm đối chứng (3 con) và nhóm PCP (3 con).
- Thí nghiệm 2: đánh giá ảnh hưởng của Ketamine lên hành vi của khỉ
Nghiên cứu sử dụng 8 khỉ (macaca mulusta, 4 con đực và 4 con cái) cân nặng từ 4 đến 6 kg. Toàn bộ khỉ được chia thành 4 cặp.
2.1.3. Đánh giá tác dụng của một số thuốc trên mô hình
Gồm 165 chuột nhắt trắng, giống đực, khỏe mạnh 8 – 10 tuần tuổi, trọng lượng 20 – 30 g, do ban chăn nuôi Học viện Quân y cung cấp.
- Nhóm xác định liều LD50: 80 con chuột nhắt, cho uống cao lỏng (3:1) của bài thuốc Tiêu dao tán – Địch đàm thang.
- Nhóm xác định độc tính trên gan, thận, máu: 10 con chuột cống, trọng lượng 200 – 300g, cho uống cao lỏng của bài thuốc Tiêu dao tán – Địch đàm thang.
- Nhóm chứng: 27 con chuột nhắt, tiêm nước muối sinh lý 0,9%.
- Nhóm ketamine: 86 con chuột nhắt, tiêm ketamine liều 20mg/kg/ngày vào màng bụng chuột trong 14 ngày liên tục để gây mô hình bệnh TTPL. Sau
đó, chia thành 3 nhóm nhỏ:
+ Nhóm clozapine: 15 con, cho uống thuốc clozapine.
+ Nhóm TDT: 15 con, cho uống cao lỏng của bài thuốc Tiêu dao tán –
Địch đàm thang.
+ Nhóm haloperidol (halo): gồm 28 chuột, đánh giá hành vi trước và sau khi gây mô hình, sau đó sẽđược tiêm haloperidol. Hành vi của chuột được đánh giá lại sau tiêm haloperidol 30 phút (ST 30 ph) của ngày tiêm đầu tiên và sau 7 ngày tiêm (ST 7 ng) liên tục.
+ Nhóm ketamine sau tiêm (ST) hay nhóm trước uống thuốc: 28 con, không điều trị, dùng để so sánh đối chứng với nhóm uống clozapine và bài thuốc (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
đông y và thuốc tây.
2.1.4. Phân tích hình ảnh não bộ và vận động của mắt trên bệnh nhân TTPL
Gồm 90 bệnh nhân chẩn đoán là TTPL thể paranoid vào điều trị nội trú tại khoa Tâm thần - Bệnh viện 103 từ tháng 8/2011 đến tháng 6/2012, có độ tuổi trung bình 30,87 ± 8,46 (từ 19 – 51), 59 nam (chiếm 65,56%), 31 nữ (chiếm 34,44%). 30 bệnh nhân được lấy ngẫu nhiên trong số 90 bệnh nhân nói trên để
chụp MRI sọ não tại khoa X Quang – Bệnh viện 103.
* Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân nghiên cứu
Các bệnh nhân được chẩn đoán là TTPL thể paranoid theo tiêu chuẩn của bảng phân loại bệnh quốc tế lần thứ 10 (ICD-10) về các rối loạn tâm thần và hành vi của WHO năm 1992, mục F20.0.
a. Tư duy vang thành tiếng, tư duy bị áp đặt hay bị đánh cắp hoặc tư duy bị
phát thanh.
b. Các hoang tưởng bị kiểm tra, chi phối hay bị động, có liên quan rõ rệt với vận động thân thể hay các chi hoặc có liên quan với những ý nghĩ, hành vi hay cảm giác đặc biệt; tri giác hoang tưởng.
c. Các ảo thanh bình phẩm thường xuyên về hành vi của bệnh nhân hay thảo luận với nhau về bệnh nhân hoặc các loại ảo thanh khác đến từ một bộ phận nào đó của cơ thể.
d. Các loại hoang tưởng dai dẳng khác không thích hợp về mặt văn hoá và hoàn toàn không thể có được như tính đồng nhất về tôn giáo hay chính trị hoặc những khả năng và quyền lực siêu nhân. Thí dụ như có khả năng điều khiển thời tiết, hoặc đang tiếp xúc với những người của thế giới khác.
e. Những ảo giác dai dẳng bất kỳ loại nào, có khi kèm theo hoang tưởng thoáng qua hay chưa hoàn chỉnh, không có nội dung cảm xúc rõ ràng hoặc kèm theo ý tưởng quá dai dẳng hoặc xuất hiện hàng ngày trong nhiều tuần hay nhiều tháng.
f. Tư duy gián đoạn hay thêm từ khi nói, đưa đến tư duy không liên quan hay lời nói không thích hợp hay ngôn ngữ bịa đặt.
g. Tác phong căng trương lực như kích động, giữ nguyên dáng hay uốn sáp, phủđịnh, không nói, sững sờ.
h. Những triệu chứng âm tính như vô cảm rõ rệt, ngôn ngữ nghèo nàn, đáp
ứng cảm xúc cùn mòn hay không thích hợp thường đưa đến cách ly xã hội hay giảm sút hiệu suất lao động xã hội; phải rõ ràng là triệu chứng nói trên không do trầm cảm hay thuốc an thần kinh gây ra.
i. Biến đổi thường xuyên và có ý nghĩa về chất lượng toàn diện của tập tính cá nhân biểu hiện như là mất thích thú, thiếu mục đích, lười nhác, thái độ mải mê suy nghĩ về bản thân và cách lý xã hội.
Yêu cầu chẩn đoán bệnh TTPL theo ICD-10:
+ Phải có ít nhất một triệu chứng rõ ràng hoặc phải có 2 triệu chứng hay nhiều hơn nữa (nếu triệu chứng ít rõ ràng) thuộc vào các nhóm từ a đến d.
+ Thời gian các triệu chứng phải tồn tại ít nhất là một tháng hay lâu hơn. + Không được chẩn đoán TTPL nếu có các triệu chứng trầm cảm hay hưng cảm mở rộng xuất hiện trước các triệu chứng nói trên.
+ Không được chẩn đoán TTPL khi có bệnh não rõ rệt hoặc bệnh nhân
đang ở trong trạng thái nhiễm độc ma túy.
+ Không được chẩn đoán TTPL khi có bệnh động kinh và các bệnh tổn thương thực thể não.
Tóm lại, các tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh TTPL theo ICD-10 là sự kết hợp hài hòa giữa các trường phái tâm thần học hiện đại với nhau và các trường phái tâm thần học cổ điển. Các tiêu chuẩn trên đã phản ánh tương đối đầy đủ các khuynh hướng và truyền thống chủ yếu về tâm thần học trên thế giới.
- Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh TTPL thể Paranoid theo ICD-10
+ Phải đáp ứng tiêu chuẩn chung cho TTPL.
+ Những hoang tưởng ảo giác phải nổi bật (như hoang tưởng bị truy hại, liên hệ, dòng dõi cao sang, sứ mệnh đặc biệt, biến hình cơ thể, hoặc ghen tuông). + Các ảo thanh đe dọa bệnh nhân hay ra lệnh hoặc các ảo giác thính giác không có dạng lời nói như huýt còi, vo ve hay cười cợt.
+ Các ảo giác khứu giác hay vị giác hay ảo giác về tình dục hoặc các cảm giác cơ thể khác. Ảo giác thị giác cũng có thể xuất hiện nhưng hiếm khi chiếm
ưu thế.
+ Cảm xúc cùn mòn hoặc không thích hợp, những triệu chứng căng trương lực, hoặc ngôn ngữ không mạch lạc phải không được chiếm ưu thế trong bệnh cảnh lâm sàng, mặc dù chúng có thể biểu hiện ở mức độ nhẹ. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
* Tiêu chuẩn loại trừ
- Loại trừ các bệnh nhân TTPL mắc các bệnh nội khoa kèm theo như sau: suy tim, viêm khớp dạng thấp, lupus ban đỏ hệ thống, đái tháo đường …
- Loại trừ các bệnh nhân không có người nhà cung cấp bệnh sử, tiền sử. - Loại trừ các bệnh nhân không hợp tác trong quá trình nghiên cứu và làm xét nghiệm.
* Tiêu chuẩn chọn nhóm chứng
- Có tuổi tương ứng với nhóm nghiên cứu - Không mắc các bệnh nội khoa mạn tính. - Hợp tác trong quá trình nghiên cứu.
2.1.5. Nghiên cứu về thay đổi hành vi, điện tế bào trên những động vật thiếu khuyết gen thụ cảm thể dopamine D1, D2 trên chuột khuyết gen thụ cảm thể dopamine D1, D2 trên chuột
17 chuột lành (25-33g), 8 chuột thiếu thụ cảm thể D1 (24-29 g), 13 chuột thiếu thụ cảm thể D2 (24-30 g) giống đực được sử dụng trong nghiên cứu ghi
điện tế bào. Các động vật được tạo sinh tại một labo hợp tác thuộc viện nghiên cứu Okazaki (Nhật Bản).
2.2. Phương tiện, hoá chất
2.2.1. Phương tiện nghiên cứu hành vi và mô hình TTPL
- Buồng thực nghiệm được quây vải đen có kích thước 1,5 × 1,5 × 1,5 m để
cách ly với môi trường xung quanh, tránh các yếu tố gây nhiễu.
- Buồng ghi đánh giá chức năng vận động của chuột, có kích thước là 40 × 40 × 100 cm, được làm bằng khung gỗ, bốn mặt là kính nhìn rõ được bên trong. Mặt đáy của buồng được chia thành 3 vùng: đáy, vùng trung tâm và đường giữa. Vùng trung tâm là một hình tròn ở chính giữa đáy buồng ghi, có đường kính 15 cm; đường giữa là một đường thẳng đi qua trung tâm chia đáy thành hai phần bằng nhau (hình 2.1). Hình 2.1. Buồng ghi đánh giá chức năng vận động. Vùng trung tâm Chuột phân tích
- Buồng ghi đánh giá hành vi tương tác xã hội của chuột, gồm hai buồng: buồng lớn được làm bằng khung gỗ có kích thước 40 × 40 × 100 cm, bốn mặt là kính; buồng nhỏ có kích thước 20 × 15 × 10 cm, mặt trên và mặt đáy được làm bằng mica, các mặt bên có các thanh inox xếp song song tạo điều kiện cho động vật giao tiếp trong quá trình nghiên cứu. Mặt đáy của buồng lớn được chia làm hai vùng: vùng giao tiếp là vùng nằm bao quanh buồng nhỏ rộng 7 cm, nơi đây xảy ra các hành vi giao tiếp của động vật, vùng ngoài là vùng còn lại của đáy, nơi không xảy ra các hành vi giao tiếp (hình 2.2).
Hình 2.2. Buồng ghi đánh giá hành vi tương tác xã hội.
- Mê lộ hình chữ thập gồm hai khung làm bằng gỗ được sơn đen có kích thước 80 × 80 cm, 1 khung có thành cao 10 cm (cánh đóng), một khung không có thành (cánh mở), hai khung này ghép với nhau tạo thành hình chữ thập, phần giao nhau gọi là vùng trung tâm. Mê lộđược đặt trên giá cao cách mặt đất 50 cm (hình 2.3). Vùng giao tiếp Buồng lớn Buồng nhỏ Vùng ngoài
Hình 2.3. Mê lộ hình chữ thập.
- Mê lộ nước: là một thùng tôn hình trụ đáy sơn đen, có đường kính 1 m, thành cao 30 cm, đổ ngập nước 18-20 cm, được chia làm 4 góc phần tư. Bến đỗ được làm bằng kính mica trong, đặt ở trung tâm một góc phần tư, ngập nước chừng 0,5-1 cm (hình 2.4).
Hình 2.4. Mê lộ nước.
- Mê lộ tìm thức ăn: là một hình hộp chữ nhật có kích thước ngoài 80 × 120 × 10 cm, được làm bằng gỗ sơn đen, trong mê lộ có nhiều đường đi hình ziczac
được tạo bởi các thanh gỗ sơn đen ghép với nhau. Mỗi đường rộng 6 cm, cao 10 cm, được cấu trúc như sau: từ cửa vào (cửa xuất phát) chỉ có một đường duy
Bến đỗ Cánh đóng Cánh mở Trung tâm Góc phần tư 2 Góc phần tư 1 Góc phần tư 3 Mép nước
nhất tới ô trung tâm nơi có chứa thức ăn, trên đường tới ô trung tâm có các ngõ cụt. Toàn bộ chiều dài đường đi từ nơi xuất phát tới ô trung tâm là 5,7 m (hình 2.5).
Hình 2.5. Mê lộ tìm thức ăn.
- Hệ thống ghi hình ảnh và phân tích hành vi ANY-maze (Stoelting) của Mỹ gồm: phần mềm, camera, máy tính, card thu thập số liệu. Đây là phần mềm thương mại của Mỹ được nhiều tác giả trên thế giới sử dụng. Phần mềm xác
định chính xác tọa độ của chuột theo thời gian với tần số quét là 30 khuôn hình/giây, từđó xác định vị trí tương đối của chuột với các vùng được định dạng và cho các thông số về tần suất và thời gian chuột ra vào, bơi, sử dụng các vùng mà ta quan tâm (hình 2.6).
Hình 2.6. Giao diện phần mềm ghi và phân tích hành vi ANY-maze (Mỹ).
2.2.2. Phương tiện nghiên cứu hình ảnh trên bệnh nhân TTPL (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Bệnh án xây dựng theo mục tiêu nghiên cứu - Bệnh án nằm viện của bệnh nhân
- Hình ảnh chụp MRI của bệnh nhân TTPL thể paranoid. - Hình ảnh chụp MRI của người bình thường.
- Thiết bị nghiên cứu hình ảnh MRI
+ Hình ảnh MRI sọ não của người bình thường và các bệnh nhân được chẩn đoán trên lâm sàng là TTPL được ghi trong các đĩa CD, với lát cắt 2 mm, trường quan sát = 256 mm và kích thước ảnh = 256 × 256 điểm ảnh. Hình ảnh MRI được phân tích làm đối chứng so sánh với kết quả phân tích.
+ Hệ thống phân tích để tính các thể tích não và các vùng quan tâm (vùng hải mã): các hình ảnh được chuyển sang máy chủ chạy trên hệ điều hành Unix (Silicon Graphics, Mountain View, CA, Mỹ). Các số liệu được xử lý với gói phần mềm Dr.View/Linux 5.0 (Asahi Kasei Joho System, Tokyo, Nhật Bản).
2.2.3. Phương tiện và dụng cụ nghiên cứu vận động mắt
- Dụng cụ: hệ thống ghi chuyển động của mắt với khung giá cốđịnh đầu, camera (hình 2.7).
- Các hình ảnh kích thích thị giác gồm: hình mặt một người và cây gỗ
hình mặt người (hình 2.8).
Hình 2.7. Khung cốđịnh đầu có gắn camera.
Hình 2.8. Hình ảnh kích thích (phải: cây hình mặt người, trái: mặt người).
2.2.4. Thiết bị nghiên cứu gen
Các thiết bị được sử dụng tại Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y được trình bày trong bảng 2.1.
Tên thiết bị Hãng sản xuất Quốc gia
Tủ lạnh sâu -80ºC, -20ºC Continental Scientific Mỹ
Pipet các loại Hamilton Mỹ
Máy đo pH Thosmas Scientific Mỹ
Máy ly tâm lạnh cao tốc Hettich Đức
Máy ly tâm Eppendorf 5415 C Eppendorf Đức
Hệ thống nhân gen: PCR, ABI 9700 Bio-Rad, Applied BioSystems
Mỹ
Máy chụp ảnh và phân tích hình ảnh gen Chemidoc XRS
Bio-Rad Mỹ
Máy điện di PowerPac 300, Bio-Rad Mỹ
Máy cô chân không loại bỏ dung môi: Speed Vac
Thermo electron Mỹ
Máy trộn mẫu IKA Mỹ
Buồng thao tác kỹ thuật di truyền Esco Singapore (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bểổn nhiệt Shellab Mỹ
Máy khuấy từ gia nhiệt IKA Mỹ
Máy quang phổ tử ngoại dùng cho sinh học phân tử: Nanodrop
Nanodrop Mỹ
Cân phân tích điện tử Adam Anh
Máy xác định trình tự ABI PRISM 3130xl Gentic Analyzer
Applied BioSystems Mỹ
Máy PCR 9700 ABI Mỹ
2.3. Hoá chất
2.3.1. Hóa chất xây dựng mô hình và thử nghiệm thuốc
- Thuốc ketamine: lọ 10ml( 50mg/ml) - Thuốc haloperidol: ống( 5mg/1ml)
- Dung dịch NaCl 0,9%.
- Thuốc Clozapine 100 mg/viên