Các kết quả nghiên cứu xác định đột biến/đa hình được trình bày trên các bảng và hình
3.3.3.1. Kết quả nhân các đoạn DNA bằng phản ứng PCR
a) DISC1-E11
Chúng tôi tiến hành tách AND tổng số từ các mẫu máu, kiểm tra nồng độ
và độ tinh sạch đạt yêu cầu. chúng tôi tiến hành tối ưu phản ứng PCR để nhân
đặc hiệu đoạn DNA DISC1-E11. Một phản ứng PCR thành công cần phải có thành phần phản ứng và chu trình nhiệt thích hợp. Thành phần của phản ứng gồm Primer, Polymerase tag, Buffer 10X, có Mg2+, dNTP và DNA template. Các thành phần này cần phải được tối ưu hóa về nồng độ trong dung dịch phản
ứng phù hợp, từ đó phản ứng PCR mới cho sản phẩm đặc hiệu, tránh được các sản phẩm phụ. Chu trình nhiệt của phản ứng cũng rất quan trọng, đặc biệt là nhiệt độ gắn primer. Nhiệt độ gắn primer phải phù hợp với từng primer. Để tìm
được nhiệt độ primer phù hợp, chúng tôi đã tiến hành phản ứng quanh điểm Tm của primer (55oC) DISC1-E11 từ 52 – 57oC, với bậc thang là 0,5 oC. Kiểm tra bằng kết quảđiện di, chúng tôi tìm được nhiệt độ gắn primer là 53 oC. Các thành phần khác của chu trình nhiệt được xác định gần giống với lý thuyết, đơn giản hơn nên chúng tôi không trình bày trong phần giải thích này.
Các thành phần sử dụng trong phản ứng PCR nhân đoạn DISC1-E11 gen DISC1 và chu trình nhiệt như trên bảng 3.55, 3.56.
Bảng 3.55. Các hóa chất dùng trong phản ứng PCR nhân đoạn DISC1- E11. Thành phần phản ứng Thể tích (µl) Buffer 10X 2,5 dNTP (10 mM) 0,4 Primer F (10 pm) 0,5 Primer R (10 pm) 0,5
Taq DNA polymease (5 unit/µl) 0,1
DNA genome (30ng/µl) 1
H2O 20
Tổng thể tích 25
Bảng 3.56. Chu trình nhiệt nhân đoạn DISC-E11, gen DISC1.
Nhiệt độ (oC) 95 95 53 72 72 4
Thời gian 5 phút 20 giây 45 giây 1phút 10phút +∞
1chu kỳ 32 chu kỳ 1 chu kỳ
Để kiểm tra xem phản ứng PCR có nhân được đoạn DNA theo yêu cầu không, chúng tôi tiến hành điện di trên gel agarose, chụp gel đánh giá kích thước của sản phẩm PCR và độđặc hiệu của phản ứng.
Hình 3.29. Kết quảđiện di sản phẩm PCR của đoạn DNA DISC1-E11. - B1-B29: Các mẫu DNA của bệnh nhân (mẫu B30 được điện di riêng) - 1 – 29: Các mẫu DNA của nhóm chứng (mẫu 30 được điện di riêng) - (-): Mẫu chứng âm.
Kết quả điện di cho thấy, kích thước băng sản phẩm điện di 480bp phù hợp với tính toán lý thuyết; các băng sáng, rõ nét.
Với phương pháp chuẩn hóa tương tự với phản ứng nhân đoạn DNA DISC1 – E11, chúng tôi cũng thu được chu trình nhiều và thành phẩn phản ứng của phản ứng PCR nhân gen DISC1 – Pro và COMT
b) DISC1-Pro
Các thành phần sử dụng trong phản ứng PCR nhân đoạn và chu trình nhiệt nhan đoạn DISC1-Pro gen DISC1 như dưới đây (bảng 3.57, 3.58):
Bảng 3.57. Các hóa chất dùng trong phản ứng PCR nhân đoạn DISC1- Pro. Thành phần phản ứng Thể tích (µl) Buffer 10X 2,5 dNTP (10 mM) 0,4 Primer F (10 pm) 0,5 Primer R (10 pm) 0,5
Taq DNA polymease (5 unit/µl) 0,1
DNA genome (30ng/µl) 1
H2O 20
Tổng thể tích 25
Bảng 3.58. Chu trình nhiệt nhân đoạn DISC-Pro, gen DISC1.
Nhiệt độ (oC) 95 95 58 72 72 4
Thời gian 5 phút 20 giây 45 giây 1 phút 10 phút +∞
Số chu kỳ 1chu kỳ 30 chu kỳ 1 chu kỳ
Hình 3.30. Kết quảđiện di sản phẩm PCR của đoạn DNA DISC1-Pro. - 1-29: Các mẫu DNA của bệnh nhân (mẫu B30 được điện di riêng) - C1 C29: Các mẫu DNA của nhóm chứng (Mẫu C30 được điện di riêng) - (-): Mẫu chứng âm.
Kết quả điện di cho thấy, kích thước sản phẩm PCR 515bp phù hợp với tính toán lý thuyết.
Như vậy, chúng tôi đã thiết kế thành công các cặp primer, chuẩn hóa được thành phần phản ứng và chu trình nhiệt của phản ứng PCR nhân các đoạn gen nghiên cứu.
3.3.3.2. Kết quả giải trình tự trên máy ABI 3130XL
Sau khi điện di trên gel agarose, chúng tôi nhận thấy các băng sản phẩm rõ nét, không thấy các băng phụ, không có smear. Điều này có thể cơ bản khẳng
định được sản phẩm chạy PCR đặc hiệu và chỉ có một sản phẩm. Trên cơ sở đó, chúng chọn phương pháp giải trình tự trực tiếp (direct sequencing) sản phẩm phản ứng PCR.
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit DNA Clean & Concentrator™ của Zymo Reseache, Mỹ. DNA sau tinh sạch được đo nồng độ và độ tinh sạch trên máy Nanodrop để kiểm tra, làm cơ sở cho phản ứng sequencing bằng bộ kit BigDye® Terminator v3.1, Cycle Sequencing Kit trên máy PCR 97000. Sản phẩm của phản ứng sequecing được đọc trên máy giải trình tự tựđộng ABI 3130 XL và phần mềm Data Collection V1.0. Các dữ liệu thu được được phân tích bằng phần mềm Seqscape 2.6, Bioedit 7.0, Clustal...
a) DISC1-E11
Chúng tôi đọc trình tự 60 mẫu sản phẩm PCR. Tuy nhiên, chúng tôi chỉ
tiến hành phân tích 49 mẫu, còn các kết quả khác không tốt. Kết quảđọc trình tự
của 49 mẫu được so sánh với trình tự của exon 11 của gen DISC1 (gồm 264 nucleotit). Kết quả so sánh được thể hiện ở hình 3.32a và hình 3.32b.
Kết quả trên hình cho thấy, có xuất hiện điểm đa hình tại vị trí 67 của exon 11, ở mẫu bệnh B1, B10, B26; mẫu chứng C9 và C26 (hình 3.31).
Để khẳng định chính xác các điểm đa hình, chúng tôi tiến hành xác định các đỉnh (pick) của các vị trí có đa hình, tiến hành kiểm tra và so sánh giữa pick của các mẫu không có đa hình và mẫu có đa hình. Khi kiểm tra chúng tôi thấy rằng, tất cả các mẫu không có đa hình, xuất hiện pick giống hình 3.31A, gọn, không xuất hiện tín hiệu nhiễu nền. Các mẫu có đa hình, vị trí này đều xuất hiện hai pick như hình 3.31B, đa hình dị hợp tử, trong đó allen T thay thế allen A. Chúng tôi đều thấy dạng dị hợp tử này ở tất cả các mẫu này có đa hình.
Trong quá trình phân tích, chúng tôi sử dụng phần mềm Seqscape 2.5 để
phân tích dữ liệu từ máy đọc trình tự. Phần mềm có chức năng so sánh trình tự
của mẫu phân tích với trình tự tham khảo đã được nhập vào từ trước. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành nhập trình tự của đoạn DNA tham khảo có chứa trình tự exon 11 của gen DISC1. Kết quả so sánh với trình tự của exon 11 được thể hiện rõ hơn ở hình 3.34a và 3.34b. Ở hai hình này, dòng trình tự
trên cùng của mỗi hình là trình tự tham khảo của exon 11. Trình tự này được lấy từ ngân hàng gen Mỹ. Ở hình 3.34a cho chúng ta thấy rất rõ các điểm đa hình tại vị trí số 67 ở exon 11 của các mẫu bệnh B1, B10, B26 và mẫu chứng C26 và C9. Các vị trí đa hình được thể hiện bằng chữ W (A hoặc T).
Nhằm xác định vị trí đa hình trên gen DISC1, chúng tôi tiến hành Blast trình tự có đa hình và tiến hành đối chiếu trên cơ sở dữ liệu của NBCI. Kết quả
Blast được thể hiện ở hình dưới đây:
Hình 3.33. Blast trình tự có đa hình và đối chiếu trên cơ sở dữ liệu của NBCI. Do các mẫu có đa hình giống nhau nên chúng tôi chỉ Blast đại diện mẫu B1. Kết quả cho thấy tương đồng 263 nucleotid/264 nucleotid.
Hình 3.34a. So sánh trình tự của các mẫu nghiên cứu và trình tự của đoạn exon 11.
Hình 3.34b. So sánh trình tự của các mẫu nghiên cứu và trình tự của đoạn exon 11.
Hình 3.35. Hình ảnh đối chiếu với các điểm đa hình trên gen NBCI.
Để xác định đa hình này đã thuộc đa hình đã biết, chúng tôi tiến hành đối chiếu trên trình tự của DISC1 trên ngân hàng gen, tìm điểm đa hình đã biết. Hình ảnh kết quả đối chiếu (hình 3.36) cho thấy, vị trí đa hình của mẫu nghiên cứu (mũi tên) tương ứng với vị trí của đa hình đã biết (allen A được thay bằng allen T). Tên của đa hình là rs821616. Các đa hình khác như rs 2806466 hoặc rs19097563 không được tìm thấy ở các mẫu nghiên cứu.
Ở các mẫu nghiên cứu biểu hiện sựđa hình dị hợp tử. Đa hình dị hợp tử
A và T ở mẫu 16 làm thay đổi bộ ba GAG mã hóa cho acid amin Serine thành bộ ba GTG mã hoá cho acid amin Valine
b) DISC1-Pro
Ngoài việc khảo sát vùng exon 11 của gen DISC1, chúng tôi còn tìm hiểu sự biến đổi của gen DISC1 ở ngay phía trước của exon 11. Biến đổi ở đoạn gen này được cho là có liên quan tới bệnh TTPL. Chúng tôi tiến hành giải trình tự
60 mẫu (60R, 60F) nhưng chỉ phân tích 45 mẫu, các mẫu khác kết quả không tốt nên không tiến hành phân tích. Kết quả giải trình tự và so sánh với trình tự
tham khảo được mô tả trong hình 3.38 a, b.
Kết quả so sánh cho thấy, hầu hết trình tự của các mẫu nghiên cứu trùng khớp với trình tự tham khảo. Chỉ có vị trí thứ 224 của mẫu bệnh B26 có xuất hiện một đa hình G/C.
Để kiểm tra chính xác điểm đa hình này, chúng tôi tiến hành kiểm tra các pick tại vị trí đa hình (hình 3.37).
Hình 3.37. Hình ảnh pick ở vị trí đa hình mẫu B26.
Quan sát trên hình thấy rõ hai pick chồng khít lên nhau. Như vậy đây là vị trí đa hình dị hợp tử. Dị hợp tử thay thế G bằng C.
Để xác định cụ thể vị trí đa hình, chúng tôi tiến hành kiểm tra bằng Blast và đối chiếu với những đa hình đã biết trên ngân hàng gen (hình 3.39).
Hình 3.39. Kết quả Blast trình tự mẫu B26.
Kết quả Blast cho thấy, trình tự của mẫu nghiên cứu có mức độ tương
đồng cao với trình tự tham khảo của ngân hàng gen 364/365 (99%).
Để xác định vị trí đa hình là đa hình đã được công bố hay chưa, chúng tôi tiến hành đối chiếu với các đa hình đã biết trên cơ sở dữ liệu của NBCI (hình 3.40). Kết quả cho thấy, đa hình của mẫu B26 tương ứng với đa hình rs3806372.
Hình 3.40. Kết quả xác định vị trí đa hình trên cơ sở dữ liệu NBCI.
3.3.3.3. Mối liên quan giữa đột biến gen với bệnh TTPL
Kết quả nghiên cứu vềđột biến, đa hình trên gen DISC1 được tổng hợp trên bảng 3.59. Bảng 3.59. Tổng hợp kết quả phát hiện ra đột biến, đa hình ở DISC1. DISC1 Rs821616 Rs3806372 Đặc điểm so sánh Có Không Có Không Bệnh nhân 3 (10,34%) 26 1 27 Chứng 2 (10%) 18 0 17 Tổng 5 45 1 44
Chúng tôi tiến hành tính mối tương quan giữa các đa hình và bệnh TTPL nhưng không có sự khác biệt. Tuy nhiên, chúng tôi vẫn thấy tỷ lệ đa hình rs821616 và rs3806372 ở nhóm bệnh cao hơn nhóm chứng. Một số tác giả báo cáo tìm thấy mối liên quan của đa hình rs821616 và bệnh TTPL [46], [59], [65], [67]. Đặc biệt Kim HJ và cs. tìm thấy mối liên quan của bệnh với đa hình rs821616 ở người Hàn Quốc [65]. Kết quả của chúng tôi khác với những công
bố trước đây có thể do nhiều yếu tố như chủng tộc, cỡ mẫu nghiên cứu. Tỷ lệđa hình rs821616 và rs3806372 ở nhóm bệnh cao hơn ở nhóm chứng, tuy nhiên mức cao không đáng kể và không có ý nghĩa thống kê. Nguyên nhân của sự
khác biệt này có thể do cỡ mẫu nghiên cứu của chúng tôi quá nhỏ. Trong khi đó cỡ mẫu của các tác giả khác lớn hơn gấp nhiều lần [65], [85], ví dụ gấp hơn 10 lần [65].
KẾT LUẬN