3. í nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
2.2.3. Thời gian nghiờn cứu
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.3. NGUYấN LIỆU DÙNG TRONG NGHIấN CỨU 2.3.1. Mẫu bệnh phẩm
- Mẫu bệnh phẩm là phủ tạng gồm: Mỏu tim, gan, lỏch, dịch ruột của lợn con dƣới 2 thỏng tuổi mắc bệnh tiờu chảy vừa chết hoặc sắp chết.
- Mẫu phõn lợn tiờu chảy và lợn bỡnh thƣờng đƣợc lấy bằng tăm bụng vụ trựng ngoỏy sõu vào trực tràng.
2.3.2. Cỏc loại mụi trƣờng, hoỏ chất
- Cỏc loại mụi trƣờng dựng cho phõn lập, nuụi cấy vi khuẩn đƣờng ruột bao gồm: Thạch mỏu, thạch MacConkey, thạch ISI, thạch DHL, thạch Brilliant Geen, nƣớc thịt BHI, nƣớc thịt thƣờng, nƣớc thịt pepton, thạch Simmons citrate và cỏc loại mụi trƣờng đƣờng Glucoze, Lactoze, Mannitol… do hóng Oxoid của Anh sản xuất.
- Cỏc loại giấy tẩm khỏng sinh của hóng Oxoid (Anh).
- Khỏng huyết thanh chuẩn dựng định type vi khuẩn phõn lập đƣợc của Nhật và Úc.
- Cỏc hoỏ chất và dụng cụ phũng thớ nghiệm khỏc dựng trong nghiờn cứu vi khuẩn.
2.3.3. Động vật thớ nghiệm: Chuột bạch khoẻ mạnh, cú trọng lƣợng trung bỡnh từ 18 - 20g/con. bỡnh từ 18 - 20g/con.
2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIấN CỨU 2.4.1. Phƣơng phỏp nghiờn cứu dịch tễ
Sử dụng phƣơng phỏp nghiờn cứu dịch tễ học mụ tả (Descriptive study) dịch tế học phõn tớch (Analytic study) và dịch tễ học thực nghiệm của Nguyễn Nhƣ Thanh (2001)[57], Nguyễn Văn Thiện (1997)[61].
Chỳng tụi dựng phƣơng phỏp nghiờn cứu cắt ngang tỡm căn nguyờn của bệnh. So sỏnh tần suất của hội chứng tiờu chảy giữa cỏc nhúm khỏc nhau. Cỏc cỏ thể trong cựng nhúm, cũng nhƣ cỏc yếu tố nguy cơ, cỏc thụng tin khỏc đều đƣợc tiến hành trong cựng thời điểm nghiờn cứu.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.4.1.1. Chọn mẫu điều tra
Chọn mẫu theo phƣơng phỏp ngẫu nhiờn, mẫu chựm nhiều bậc. Chọn ngẫu nhiờn mỗi huyện 3 xó, mỗi xó ngẫu nhiờn chọn 3 thụn; trong thụn điều tra cỏc hộ chăn nuụi lợn nỏi sinh sản và lợn con dƣới 2 thỏng tuổi.
- Số huyện đƣợc điều tra: 3; số xó, Thị Trấn là: 9; số thụn, khu là: 27. - Số lần điều tra: 4 lần theo cỏc mựa (mựa thu, mựa đụng trong năm 2009; mựa xuõn, mựa hố trong năm 2010).
2.4.1.2. Phương phỏp
- Trực tiếp quan sỏt để phỏt hiện lợn tiờu chảy. Những lợn phõn lỏng đƣợc coi là bị tiờu chảy (loại trừ những lợn bị bệnh truyền nhiễm cú triệu chứng tiờu chảy).
- Phỏng vấn chủ hộ chăn nuụi về những thụng tin cần thiết. - Thụng tin điều tra đƣợc ghi vào cỏc phiếu điều tra.
2.4.1.3. Nội dung điều tra, theo dừi
- Số lợn con mắc tiờu chảy và chết do tiờu chảy tại cỏc hộ, cỏc trang trại chăn nuụi.
- Cỏc triệu chứng thƣờng gặp ở lợn con mắc tiờu chảy.
- Cỏc triệu chứng, bệnh tớch ở lợn mắc tiờu chảy khi tiến hành mổ khỏm, lấy mẫu bệnh phẩm.
- Phƣơng thức chăn nuụi và việc thực hiện vệ sinh chuồng trại.
2.4.1.4. Cỏc phương phỏp đo lường trong dịch tờ̃
Số lợn tiờu chảy
- Tỷ lệ lợn mắc tiờu chảy (%) = x 100
Tổng số lợn điều tra Số lợn tiờu chảy theo độ tuổi
- Tỷ lệ tiờu chảy theo độ tuổi (%) = x 100 Tổng số lợn theo độ tuổi
đƣợc điều tra Số lợn chết do tiờu chảy
- Tỷ lệ chết do tiờu chảy (%) = x 100 Tổng số lợn mắc tiờu chảy
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.4.1.5. Phương phỏp phõn tớch dịch tờ̃
Để so sỏnh nguy cơ mắc bệnh tiờu chảy và chết do bệnh tiờu chảy ở lợn theo lứa tuổi, mựa vụ, phƣơng thức chăn nuụi, chỳng tụi dựng chỉ tiờu nguy cơ tƣơng đối (Relative Risk - RR).
Theo Nguyễn Nhƣ Thanh (2001)[57] nguy cơ tƣơng đối, biểu thị bằng cỏc nguy cơ so sỏnh và đƣợc định nghĩa là nguy cơ phỏt triển một bệnh trong số cỏc cỏ thể cú cảm nhiễm (cú tiếp xỳc) với yếu tố nguy cơ nghi ngờ, đƣợc so sỏnh với nguy cơ phỏt triển bệnh đú, trong số cỏc cỏ thể khụng cảm nhiễm (khụng tiếp xỳc) với yếu tố nguy cơ đú.
Để so sỏnh một yếu tố nguy cơ với cỏc nhúm bệnh và nhúm đối chứng liệu dịch tễ học đƣợc thể hiện ở bảng sau:
Khai thỏc sau khi chọn
Chủ động chọn vào nghiờn cứu
Bệnh trạng
Cộng
Cú Khụng
Cảm nhiễm khi tiếp xỳc với nguy cơ
Cú a b a + b
Khụng c d c + d
Cộng a + c b + d a + b + c + d
Trong đú:
a: Số gia sỳc đƣợc chọn là cú bệnh, cú tiếp xỳc với yếu tố nguy cơ b: Số gia sỳc khụng cú bệnh, nhƣng tiếp xỳc với yếu tố nguy cơ c: Số gia sỳc cú bệnh nhƣng khụng cú tiếp xỳc
d: Số gia sỳc khụng cú bệnh và cũng khụng cú tiếp xỳc. Nguy cơ tƣơng đối đƣợc tớnh theo cụng thức sau:
/( ) /( ) Ie a a b RR Io c c d Trong đú:
Ielà tỷ lệ mắc bệnh ở nhúm cú cảm nhiễm với yếu tố nguy cơ.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Đỏnh giỏ kết quả:
+ Nếu RR > 1 núi lờn sự liờn quan giữa bệnh và cảm nhiễm với yếu tố nguy cơ, trị số RR càng lớn thỡ sự kết hợp giữa bệnh và cảm nhiễm càng mạnh.
+ RR = 1 núi lờn bệnh và cảm nhiễm khụng cú liờn quan gỡ đến nhau. + RR < 1 núi lờn một kết hợp õm tớnh
* Dựng khi bỡnh phƣơng ( 2
)so sỏnh tần suất bệnh: Bằng cụng thức của Nguyễn Văn Thiện và cs (2002)[61]:
2 2 ( ) ( ) ( )( )( )( ) TN ad bc a b c d a b c d a c b d
Cỏc số liệu ỏp dụng trong nguy cơ tƣơng đối
Tỡm giỏ trị 2ứng với độ tự do v(111)(12 1) (2 1)(2 1) 1
Ta tỡm đƣợc cỏc giỏ trị 2=3,8; 6,6; 10,8 với mức = 0,05; 0,01; 0,001 bằng cỏch tra bảng.
So sỏnh 2
TN
với 2để tỡm xỏc suất xuất hiện cỏc giỏ trị 2
TN
hoàn toàn do ngẫu nhiờn sinh ra.
Đỏnh giỏ kết quả: Nếu 2 2
TN
tức P > 0,05 thỡ kết quả khụng cú sự sai khỏc giữa 2 tỷ lệ. Nếu 2 2
TN
tức P < 0,05 thỡ kết luận cú sự sai khỏc giữa 2 tỷ lệ ở mức .
2.4.2. Thu thập mẫu và phõn lập vi khuẩn
2.4.2.1. Thu thập mẫu
- Mẫu phõn phõn lập vi khuẩn: Dựng tăm bụng vụ trựng ngoỏy sõu vào trực tràng lợn mắc tiờu chảy chƣa dựng thuốc (khỏng sinh) điều trị. Khi toàn bộ tăm bụng thấm ƣớt phõn lợn, lấy ra, cho ngay vào tuýp, vặn chặt và ghi ký hiệu mẫu. Sau đú, cho vào bảo quản lạnh 2 - 40C trong thựng bảo ụn.
- Mẫu chất chứa đếm số lƣợng vi khuẩn: Mỗi con lợn lấy 3 - 6 mẫu ở cỏc vị trớ khỏc nhau của ruột, mỗi mẫu là 1 gram chất chứa ở trong ruột lợn ngay khi vừa mổ khỏm.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Mẫu bệnh phẩm gồm: Mỏu tim, lỏch, gan, hạch ruột, chất chứa ruột non, ruột già của lợn tiờu chảy.
- Mẫu đƣợc bảo quản trong điều kiện lạnh 40C, theo quy trỡnh bảo quản mẫu của Bộ mụn Vi trựng, Viện Thỳ y và đƣợc vận chuyển ngay đến phũng nghiệm để tiến hành cỏc xột nghiệm tiếp theo.
2.4.2.2. Phõn lập và giỏm định vi khuẩn
Cỏc phƣơng phỏp nuụi cấy và giỏm định vi khuẩn đƣợc thực hiện theo quy trỡnh nghiờn cứu thƣờng quy của Bộ mụn Vi trựng, Viện Thỳ y.
Mẫu là phủ tạng, phõn hoặc chất chứa trong ruột của lợn cú triệu chứng tiờu chảy đƣợc ria cấy lờn cỏc mụi trƣờng thạch mỏu, thạch MacConkey và thạch DHL bồi dƣỡng ở tủ ấm 370C trong 24 giờ. Trờn cỏc đĩa thạch sau 18 - 24 giờ nuụi cấy ở 370C cú thể quan sỏt thấy cỏc dạng khuẩn lạc nhƣ sau:
TT Loại vi khuẩn
Màu sắc và hỡnh thỏi khuẩn lạc trờn cỏc loại mụi trƣờng sau khi nuụi cấy ở 370
C/ 24h Thạch mỏu Thạch
MacConkey Thạch DHL
1 E.coli Trắng đục, gọn, dung
huyết hoặc khụng Đỏ, khụng nhày Hồng cỏnh sen
2 Salmonella spp Trắng đục, gọn,
khụng dung huyết Trắng đục Đen, trũn, gọn
3 Proteus Mọc lan tràn Trắng 4 Enterobacter aerogenes Trắng đục, trũn Hồng, nhày 5 Enterococcus faecalis Trong, nhỏ, dung huyết hoặc khụng dung huyết Đỏ, mịn, trũn
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hỡnh 2.1. Sơ đồ quy trỡnh phõn lập và xỏc định cỏc yếu tố gõy bệnh của vi khuẩn E.coli (Bộ mụn Vi trựng, Viện Thỳ y)
Thạch MacConkey, tủ ấm 37oC/24-48h
Chọn khuẩn lạc nghi là vi khuẩn E.coli
Thạch Mỏu, Thạch MacConkey tủ ấm 37o
C/24-48h (để tạo giống thuần)
Kiểm tra hỡnh thỏi vi khuẩn
Kiểm tra đặc tớnh sinh húa - Sinh Indol - Lờn men đƣờng - Di động - H2S... Giữ giống Xỏc định khả năng mẫn cảm với khỏng
sinh của E.coli
Xỏc định serotype bằng phản ứng ngƣng kết nhanh trờn phiến kớnh Xỏc định cỏc yếu tố gõy bệnh Xỏc định độc lực Cấy thuần Thạch mỏu, tủ ấm 37oC/24-48h Bệnh phẩm
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Căn cứ vào màu sắc, hỡnh dạng khuẩn lạc trờn cỏc mụi trƣờng mà cú thể xỏc định và phõn loại vi khuẩn đƣờng ruột. Những khuẩn lạc điển hỡnh của vi khuẩn E.coli đƣợc phiết kớnh kiểm tra hỡnh thỏi và tiến hành giỏm định bằng cỏc đặc tớnh sinh vật, hoỏ học của vi khuẩn. Xỏc định là thuần khiết thỡ dựng trong việc xỏc định Serotype và giữ giống để tiến hành cỏc thớ nghiệm khỏc.
2.4.3. Xỏc định số lƣợng vi khuẩn E.coli trong 1 gam phõn lợn tiờu chảy và lợn bỡnh thƣờng và lợn bỡnh thƣờng
Mẫu là 1 g phõn lợn bị tiờu chảy hoặc lợn bỡnh thƣờng, đƣợc pha loóng trong dung dịch PBS thành cỏc nồng độ 10-1
, 10-2,..., 10-8. Lấy 0,1 ml dung dịch ở cỏc nồng độ đó pha loóng 10-6
, 10-7, 10-8 nhỏ và dàn đều trờn bề mặt thạch MacConkey, thạch DHL, bồi dƣỡng ở 370C trong 24 giờ. Mỗi nồng độ pha loóng, dựng 3 đĩa thạch. Đếm số khuẩn lạc E.coli mọc trờn đĩa thạch, rồi tớnh trung bỡnh cho mỗi nồng độ.
Số lƣợng vi khuẩn đƣợc tớnh theo cụng thức: X = 10 x a x b
Trong đú: X là tổng số lƣợng vi khuẩn cú trong 1 gam phõn hoặc 1 gam chất chứa đƣờng ruột.
a là số lƣợng vi khuẩn trung bỡnh của 1 nồng độ pha loóng b là hệ số pha loóng mẫu
Hệ số 10: vỡ cấy 0,1ml
2.4.4. Phƣơng phỏp xỏc định serotype khỏng nguyờn O của cỏc chủng vi khuẩn E.coli phõn lập đƣợc khuẩn E.coli phõn lập đƣợc
Đƣợc thực hiện theo phƣơng phỏp ngƣng kết nhanh trờn phiến kớnh; cỏc chủng vi khuẩn đƣợc tiến hành xỏc định nhúm với cỏc huyết thanh đa giỏ trƣớc, sau đú đến cỏc huyết thanh đơn giỏ trong nhúm.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Chuẩn bị:
+ Chủng vi khuẩn E.coli cần xỏc định serotype đƣợc cấy trờn thạch mỏu cừu, ủ ở tủ ấm 370
C trong 18 - 24 giờ.
+ Cỏc khỏng huyết thanh O chuẩn (đa giỏ và đơn giỏ) do hóng Denka, Seiken Co., Ltd, Niigata, Nhật cung cấp.
+ Nƣớc muối sinh lý 0.85%, phiến kớnh sạch, que cấy nhựa.
- Phương phỏp tiến hành phản ứng ngưng kết nhanh trờn phiến kớnh như sau:
Nhỏ lờn phiến kớnh sạch, mỗi đầu một giọt nƣớc muối sinh lý, dựng que cấy vụ trựng, lấy khuẩn lạc E.coli cần xỏc định đó đƣợc nuụi trờn mụi trƣờng thạch mỏu, trộn đều với 2 giọt nƣớc muối sinh lý để tạo thành huyễn dịch vi khuẩn. Nhỏ một giọt khỏng huyết thanh chuẩn vào một bờn huyễn dịch và một giọt nƣớc sinh lý vào bờn huyễn dịch cũn lại (đối chứng). Nếu cú phản ứng ngƣng kết, sẽ xuất hiện trong vũng 30 giõy. Phản ứng dƣơng tớnh khi hỡnh thành ngƣng kết giữa khỏng nguyờn là vi khuẩn với khỏng huyết thanh, tạo thành những hạt nhỏ trắng lấm tấm, huyễn dịch tỏch ra làm 2 phần là cỏc hạt ngƣng kết và phần nƣớc trong. Với phản ứng ngƣng kết xảy ra nhanh, rừ rệt thỡ đƣợc đỏnh giỏ mức ++++. Tựy theo khả năng ngƣng kết để cú thể đỏnh giỏ mức ngƣng kết ở cỏc mức độ khỏc nhau +, ++, +++. Phản ứng là õm tớnh khi hỗn dịch vi khuẩn với khỏng huyết thanh đục đều nhƣ bờn đối chứng.
Với những chủng cú ngƣng kết với khỏng huyết thanh đa giỏ, tiếp tục thực hiện nhƣ vậy với cỏc khỏng huyết thanh đơn giỏ thuộc nhúm để xỏc định rừ từng serotype. Trong trƣờng hợp cỏc chủng cú hiện tƣợng ngƣng kết chộo với nhiều nhúm hoặc ngƣng kết với nhiều đơn giỏ khỏc nhau, thỡ phải pha loóng khỏng huyết thanh theo cấp số 2, kết quả sẽ lấy ngƣng kết ở cấp số pha loóng cao nhất.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.4.5. Phƣơng phỏp xỏc định cỏc yếu tố gõy bệnh của cỏc chủng vi khuẩn
E.coli phõn lập đƣợc
2.4.5.1. Phương phỏp xỏc định khả năng dung huyết của cỏc chủng vi khuẩn phõn lập được
Vi khuẩn E.coli đƣợc cấy trực tiếp lờn thạch mỏu cừu, bồi dƣỡng 370C trong 24 giờ, sau đú để ra ngoài điều kiện thƣờng của phũng thớ nghiệm khoảng 2 đến 3 giờ để dung huyết diễn ra hoàn toàn. Căn cứ vào đặc điểm của dung huyết làm cơ sở để đỏnh giỏ cỏc dạng dung huyết , , .
Dung huyết là dạng dung huyết mờ, khụng hoàn toàn. Dung huyết là dạng dung huyết trong hoàn toàn. Khụng dung huyết hay dung huyết .
2.4.5.2. Xỏc định cỏc yếu tố gõy bệnh (độc tố và yếu tố bỏm dớnh) của vi khuẩnE.coli bằng phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) khuẩnE.coli bằng phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)
Cỏc phƣơng phỏp PCR dựng để xỏc định một số yếu tố độc lực cơ bản của vi khuẩn đƣợc thực hiện với một số cải tiến về phƣơng phỏp và quy trỡnh thực hiện phản ứng. Cú thể túm tắt nhƣ sau:
- AND đớch: Là một lƣợng nhỏ khuẩn lạc của chủng vi khuẩn cần xỏc định đó đƣợc nuụi cấy trờn đĩa thạch mỏu cừu, ủ ở tủ ấm 370
C trong vũng 18 đến 24 giờ.
- Cỏc chủng vi khuẩn E.coli chuẩn quốc tế, dựng làm đối chứng dƣơng (đó đƣợc kiểm định chắc chắn cú mang cỏc gen quy định cỏc yếu tố độc lực) hoặc đối chứng õm (khụng mang gen sinh yếu tố độc lực), bao gồm: K514/ pLN301 (Iss), NCCB 1395 (CvaC), BM2 - 1 (Cnf1), 711 vir (Cnf2), FD635 (eae), FD636 (Stx1), FD636 (Stx2) và FD527 (đối chứng õm).
- Cỏc cặp mồi cho phản ứng PCR: Do hóng Life Technologies (Gibco, BRL) sản xuất và đƣợc bảo quản ở nhiệt độ - 200C. Thứ tự chuỗi DNA của cỏc cặp mồi đƣợc trỡnh bày ở bảng 2.1.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 2.1. Ký hiệu chuỗi DNA của cỏc cặp mồi dựng để xỏc định một số yếu tố độc lực của vi khuẩn APEC và kớch cỡ của cỏc sản phẩm sau quỏ trỡnh điện di
Gen đớch
Ký hiệu
primers Thứ tự chuỗi DNA Kớch cỡ sản phẩm (bP) Yếu tố độc lực cần xỏc định
FimA FimA - F FimA - R
5’- GTT GAT CAAGTT CAG - 3’
5’- AAT AAC GCG CCT GGA ACG - 3’ 331 F1 Fimbriae (protein chớnh)
FimH FimH - F FimH - R
5’- TGC AGA ACG GAT AAG CCG TGG - 3’
5’- GCA GTC ACC TGC CCT CCG TGG - 3’ 508 F1 Fimbriae (tiờu chuẩn bỏm dớnh) eae eae - F
eae - R
5’- ACG TTG CAG CAT GGG TAA CT - 3’
5’- GAT CGG CAA CAG TTT CAC CTG - 3’ 816 Protein Intimin (bỏm dớnh và xõm nhập) PapC PapC- F
PapC- R
5’- GAC GGC TGT ACT GCA GGG TGT GGC G - 3’
5’- ATA TCC TTT CTG CAG GGA TGC AAT A - 3’ 328 P - Fimbriae operon
IutA IutA- F IutA- R
5’- GGC TGG ACA TGG GAA CTG G - 3’
5’- CGT CGG GAA CGG GTA GAA TCG - 3’ 300
Điểm tiếp nhận aerobactin IucA IucA- F
IucA- R
5’- ATT ATG ATC CTG CCC TCT GA - 3’
5’- ATC GCG GCT GGT AGC ACA GTA GA - 3’ 821 Tổng hợp aerobactin
Tsh Tsh- F
Tsh- R
5’- AAG TCT GTC AGA CGT CTG TGT T - 3’
5’- GGA TAG CGC TCC TTA TCC AGA T - 3’ 478
Ngƣng kết hồng cầu tố mẫn cảm nhiệt độ