3. í nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
2.4.5. Phƣơng phỏp xỏc định cỏc yếu tố gõy bệnh của cỏc chủng
E.coli phõn lập đƣợc
2.4.5.1. Phương phỏp xỏc định khả năng dung huyết của cỏc chủng vi khuẩn phõn lập được
Vi khuẩn E.coli đƣợc cấy trực tiếp lờn thạch mỏu cừu, bồi dƣỡng 370C trong 24 giờ, sau đú để ra ngoài điều kiện thƣờng của phũng thớ nghiệm khoảng 2 đến 3 giờ để dung huyết diễn ra hoàn toàn. Căn cứ vào đặc điểm của dung huyết làm cơ sở để đỏnh giỏ cỏc dạng dung huyết , , .
Dung huyết là dạng dung huyết mờ, khụng hoàn toàn. Dung huyết là dạng dung huyết trong hoàn toàn. Khụng dung huyết hay dung huyết .
2.4.5.2. Xỏc định cỏc yếu tố gõy bệnh (độc tố và yếu tố bỏm dớnh) của vi khuẩnE.coli bằng phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) khuẩnE.coli bằng phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)
Cỏc phƣơng phỏp PCR dựng để xỏc định một số yếu tố độc lực cơ bản của vi khuẩn đƣợc thực hiện với một số cải tiến về phƣơng phỏp và quy trỡnh thực hiện phản ứng. Cú thể túm tắt nhƣ sau:
- AND đớch: Là một lƣợng nhỏ khuẩn lạc của chủng vi khuẩn cần xỏc định đó đƣợc nuụi cấy trờn đĩa thạch mỏu cừu, ủ ở tủ ấm 370
C trong vũng 18 đến 24 giờ.
- Cỏc chủng vi khuẩn E.coli chuẩn quốc tế, dựng làm đối chứng dƣơng (đó đƣợc kiểm định chắc chắn cú mang cỏc gen quy định cỏc yếu tố độc lực) hoặc đối chứng õm (khụng mang gen sinh yếu tố độc lực), bao gồm: K514/ pLN301 (Iss), NCCB 1395 (CvaC), BM2 - 1 (Cnf1), 711 vir (Cnf2), FD635 (eae), FD636 (Stx1), FD636 (Stx2) và FD527 (đối chứng õm).
- Cỏc cặp mồi cho phản ứng PCR: Do hóng Life Technologies (Gibco, BRL) sản xuất và đƣợc bảo quản ở nhiệt độ - 200C. Thứ tự chuỗi DNA của cỏc cặp mồi đƣợc trỡnh bày ở bảng 2.1.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 2.1. Ký hiệu chuỗi DNA của cỏc cặp mồi dựng để xỏc định một số yếu tố độc lực của vi khuẩn APEC và kớch cỡ của cỏc sản phẩm sau quỏ trỡnh điện di
Gen đớch
Ký hiệu
primers Thứ tự chuỗi DNA Kớch cỡ sản phẩm (bP) Yếu tố độc lực cần xỏc định
FimA FimA - F FimA - R
5’- GTT GAT CAAGTT CAG - 3’
5’- AAT AAC GCG CCT GGA ACG - 3’ 331 F1 Fimbriae (protein chớnh)
FimH FimH - F FimH - R
5’- TGC AGA ACG GAT AAG CCG TGG - 3’
5’- GCA GTC ACC TGC CCT CCG TGG - 3’ 508 F1 Fimbriae (tiờu chuẩn bỏm dớnh) eae eae - F
eae - R
5’- ACG TTG CAG CAT GGG TAA CT - 3’
5’- GAT CGG CAA CAG TTT CAC CTG - 3’ 816 Protein Intimin (bỏm dớnh và xõm nhập) PapC PapC- F
PapC- R
5’- GAC GGC TGT ACT GCA GGG TGT GGC G - 3’
5’- ATA TCC TTT CTG CAG GGA TGC AAT A - 3’ 328 P - Fimbriae operon
IutA IutA- F IutA- R
5’- GGC TGG ACA TGG GAA CTG G - 3’
5’- CGT CGG GAA CGG GTA GAA TCG - 3’ 300
Điểm tiếp nhận aerobactin IucA IucA- F
IucA- R
5’- ATT ATG ATC CTG CCC TCT GA - 3’
5’- ATC GCG GCT GGT AGC ACA GTA GA - 3’ 821 Tổng hợp aerobactin
Tsh Tsh- F
Tsh- R
5’- AAG TCT GTC AGA CGT CTG TGT T - 3’
5’- GGA TAG CGC TCC TTA TCC AGA T - 3’ 478
Ngƣng kết hồng cầu tố mẫn cảm nhiệt độ
Iss Iss- F Iss- R
5’- GTG GCG AAA ACT AGT AAA ACA GC - 3’
5’- CGC CTC GGG GTG GAT AA - 3’ 760 Tăng khả năng sống trong huyết thanh
CvaC CvaC- F CvaC- R
5’- TAT GAG AAC TCT GAC TCT AAA T- 3’
5’- ATT TAT AAA CAA ACA TCA CTA A - 3’ 559 Gen cấu trỳc của protein
Stx1 Stx1- F Stx1- R
5’- CAG TTA ATG TGG TGG CGA AG - 3’
5’- CTG CTA ATA GTT CTG CGC ATG - 3’ 894 Độc tố Shiga 1
Stx2 Stx2- F Stx2- R
5’- CTT CGG TAT CCT ATT CCC GG - 3’
5’- GGA TGC ATC TCT GGT CAT TG -3’ 481 Độc tố Shiga 2
Cnf1 Cnf1- F Cnf1- R
5’- AGG AAG TTA TAT TTC CGT AGG - 3’
5’- GTA TTT GCC TGA ACC GTA A - 3’ 498
Yếu tố gõy độc và hoại tử tế bào loại 1
Cnf2 Cnf2 F Cnf2 R
5’- AAT CTA ATT AAA GAG AAC - 3’
5’- CAT GCT TTG TAT ATC TA - 3’ 543
Yếu tố gõy độc và hoại tử tế bào loại 2
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Phản ứng PCR: Hỗn hợp phản ứng (25l) gồm 2,5 l 10 x PCR buffer (750 mM Tris-HCl (pH 8,8), 200 mM (NH4)2SO4
,
0,1% (v/v) Tween20); 2mM MgCl2; 200M dNTP mỗi loại (dATP, dCTP,dGTP and dCTP) (Life Technologies), 1l primer (3,2 M/l); 0,25 U Taq DNA polymerase (Advanced Biotechnologies), DNA của chủng vi khuẩn cần kiểm tra (lấy trực tiếp từ lạc khuẩn vi khuẩn trờn mụi trƣờng thạch mỏu) và nƣớc cất (Gibco, BRL) vừa đủ 25l.
Phản ứng PCR đƣợc tiến hành trong mỏy nhõn gen (Mastercycler, Eppendorf) theo cỏc chu trỡnh nhƣ sau: 940C/ 5 phỳt (1 chu kỳ); 940
C/ 1 phỳt, Tm/1 phỳt, 720C/ 1 phỳt (30 chu kỳ); 720C/ 7 phỳt, trong đú Tm là nhiệt độ tan chảy thớch hợp của mỗi loại primer.
- Điện di: Cỏc sản phẩm HNA thu đƣợc sau quỏ trinh PCR đƣợc tiến hành chạy điện di trờn thạch agarose 2% (Gibco, BRL) với hiệu điện thế 100V trong 30 phỳt. Nhuộm với TAE cú bổ sung Ethidium bromide trong 15 phỳt. Cỏc sản phẩm đƣợc quan sỏt dƣới đốn UV (300nm), dựng hệ thống Gel Doc 2000 (Bio - Rad). Ảnh đƣợc lƣu giữ lại và đƣợc tiến hành xử lý kết quả khi cần thiết.
2.4.6. Phƣơng phỏp xỏc định độc lực của cỏc chủng vi khuẩn E.coli
- Xỏc định độc lực của cỏc chủng vi khuẩn E.coli gõy bệnh đƣợc thực hiện bằng phƣơng phỏp tiờm truyền động vật thớ nghiệm.
* Phương phỏp tiờm truyền qua động vật thớ nghiệm
Cỏc bƣớc thực hiện nhƣ sau:
Bước 1: Cỏc chủng vi khuẩn thuần từ mụi trƣờng giữ giống đƣợc cấy vào mụi trƣờng BHI trong bỡnh tam giỏc 100 ml sau đú canh trựng đƣợc bồi dƣỡng ở 370C trong 24 giờ, trong quỏ trỡnh nuụi cú lắc để kớch thớch sự tăng sinh của vi khuẩn.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bước 2: Tiờm mỗi chủng vi khuẩn cần nghiờn cứu cho 2 chuột nhắt trắng khỏe mạnh, khối lƣợng từ 18 - 20 g/con, với liều 0,2 ml/chuột, tiờm xoang phỳc mạc. Trong thớ nghiệm, mỗi lụ chuột để 2 con tiờm dung dịch BHI làm đối chứng.
Bước 3: Cho chuột ăn, uống bỡnh thƣờng và theo dừi những biểu hiện, triệu chứng phản ứng sau tiờm. Kiểm tra và đỏnh giỏ số chuột tới 7 ngày.
Căn cứ vào số lƣợng chuột chết, giờ chuột chết bỡnh quõn của mỗi lụ để đỏnh giỏ độc lực của vi khuẩn .
Bước 4: Những chuột chết đƣợc đỏnh giỏ qua lõm sàng, mổ khỏm kiểm tra sự biến đổi của cỏc cơ quan nội tạng, sau đú tiến hành nuụi cấy và phõn lập lại vi khuẩn từ cỏc mẫu bệnh phẩm (mỏu tim) của chuột chết.
2.4.7. Phƣơng phỏp xỏc định khả năng mẫn cảm với khỏng sinh của cỏc chủng vi khuẩn E.coli phõn lập đƣợc chủng vi khuẩn E.coli phõn lập đƣợc
- Khả năng mẫn cảm với khỏng sinh của cỏc chủng vi khuẩn E.coli phõn lập đƣợc kiểm tra bằng phƣơng phỏp khuyếch tỏn trờn đĩa thạch và đỏnh giỏ kết quả theo Hội đồng quốc gia Hoa Kỳ về cỏc tiờu chuẩn lõm sàng phũng thớ nghiệm (NCCLS) (1999)[97].
- Phƣơng phỏp tiến hành nhƣ sau:
+ Bước 1: Chuẩn bị mụi trƣờng thạch đĩa Muller Hiton
+ Bước 2: Cỏc chủng vi khuẩn E.coli đƣợc nuụi cấy trong mụi trƣờng thạch mỏu ở 370C. Lấy 1/2 khuẩn lạc, hũa vào 1,5 ml nƣớc sinh lý để đạt đƣợc độ đục 0,5 trong dóy so màu McFarland. Dựng tăm bụng vụ trựng, tẩm dung dịch đó pha loóng và dàn đều lờn thạch đĩa Muller Hinton.
+ Bước 3: Dựng mỏy tự động đặt cỏc khoanh giấy tẩm khỏng sinh của hóng Oxioid (Anh) lờn mặt đĩa thạch.
+ Bước 4: Bồi dƣỡng đĩa thạch ở 370
C/ 18 - 24 giờ. Đọc kết quả bằng cỏch đo đƣờng kớnh vũng vụ khuẩn và so sỏnh với bảng chuẩn để đỏnh giỏ
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
mức độ mẫn cảm hay khỏng khỏng sinh của chủng vi khuẩn E.coli kiểm tra (bảng 2.2).
Bảng 2.2. Tiờu chuẩn đỏnh giỏ mức độ mẫn cảm và khỏng khỏng sinh theo NCCLS (1999) Khỏng sinh Vũng vụ khuẩn (đƣờng kớnh mm) Khỏng Mẫn cảm trung bỡnh Mẫn cảm Trimthoprim-Sulphamethoxazole 10 11 - 15 16 Streptomycin 11 12 - 14 15 Gentamicin 12 13 - 17 18 Neomycin 12 13 - 14 15 Cephalothin 14 15 - 17 18 Amikacin 14 15 - 16 17 Apramycin 10 11 - 14 15 Ceftiofur 17 18 - 20 21 Lincospectinomycin 10 11 - 13 14 Enrofloxacin (Batril) 16 17 - 19 20 Ampicillin 11 12 - 14 15 Tetracyclin 14 15 - 18 19 Flumequine ≤ 10 11 - 13 ≥ 14 Amoxycillin ≤ 11 12 - 15 ≥ 16
2.4.8. Xõy dựng phỏc đồ điều trị tiờu chảy ở lợn con dƣới 2 thỏng tuổi
Qua xỏc định sự mẫn cảm của cỏc vi khuẩn gõy bệnh phõn lập đƣợc với cỏc khỏng sinh, húa dƣợc bằng phƣơng phỏp khỏng sinh đồ trờn thạch, trờn cơ sở đú lựa chọn phỏc đồ điều trị bệnh thớch hợp. Để đỏnh giỏ đƣợc hiệu quả một cỏch khỏch quan, cỏc phỏc đồ đƣợc thực hiện cú sự đồng đều tƣơng đối về cỏc tiờu chớ cơ bản sau:
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Số lợn dƣới 2 thỏng tuổi ở cựng một địa phƣơng đƣợc phõn ra ngẫu nhiờn làm 3 lụ tƣơng ứng với 3 phỏc đồ điều trị bệnh.
- Số lần và ngày điều trị bệnh đƣợc dựng đồng đều trong cỏc phỏc đồ. - Đỏnh giỏ hiệu quả của cỏc phỏc đồ điều trị bệnh căn cứ vào sự ổn định dần về hiện tƣợng tiờu chảy, trạng thỏi phõn, tỡnh trạng ăn, uống… sau 5 đến 7 ngày kể từ khi dựng thuốc.
- Cỏc phỏc đồ nhƣ sau:
+ Phỏc đồ 1: Dựng loại thuốc MARCETIUS-NEW do cụng ty cổ phần
thuốc thỳ y Marphavet sản xuất (thành phần: Ceftiofur....5g/100ml), liều lƣợng: 1ml/10kg thể trọng/ngày; tiờm bắp: 1 lần/ ngày.
Điện giải-Gluco-K-C, pha nƣớc uống với liều: 5-10g/con/ ngày. ADE B-complex, liều lƣợng: 1-2ml/con; tiờm bắp: 1lần/ ngày. + Phỏc đồ 2: Dựng loại thuốc MARPHAMOX do cụng ty cổ phần thuốc thỳ y Marphavet sản xuất (thành phần: Amoxycillin...15g/100ml), liều lƣợng 1ml/10kg thể trọng/ngày ; tiờm bắp 1 lần/ngày.
Điện giải-Gluco-K-C, pha nƣớc uống với liều: 5-10g/con/ ngày. ADE B-complex, liều lƣợng: 1-2ml/con; tiờm bắp: 1lần/ ngày. + Phỏc đồ 3: Dựng loại thuốc MARFLUQUYL do cụng ty cổ phần
thuốc thỳ y Marphavet sản xuất (thành phần: Flumequine...9g/100ml), liều lƣợng 1ml/5kg thể trọng/ngày; tiờm bắp 1 lần/ngày.
Điện giải-Gluco-K-C, pha nƣớc uống với liều: 5-10g/con/ ngày. ADE B-complex, liều lƣợng: 1-2ml/con; tiờm bắp: 1lần/ ngày.
2.4.9. Phƣơng phỏp xử lý số liệu
Cỏc số liệu thu thập đƣợc, xử lý theo phƣơng phỏp toỏn học thụng dụng và thống kờ sinh vật học của Nguyễn Văn Thiện (1997)[61], Nguyễn Văn Thiện và cs (2002)[62].
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn Cỏc tham số thống kờ cơ bản: - Số trung bỡnh mẫu: xi X = n xi: Tổng cỏc giỏ trị của x n : Dung lƣợng mẫu. X : Số trung bỡnh mẫu. - Độ lệch tiờu chuẩn: + Với n > 30: 2 2 i i x Σx Σx S n n + Với n 30: 2 2 i i x Σx Σx S n - 1 n
Trong đú: SX: Độ lệch tiờu chuẩn Xi: Giỏ trị của mẫu n : Dung lƣợng mẫu - Sai số của số trung bỡnh:
+ Với n > 30: x x S m n + Với n 30: x x S m n - 1
Trong đú: mX: Sai số của số trung bỡnh
SX: Độ lệch tiờu chuẩn n : Dung lƣợng mẫu
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ NGHIấN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỘI CHỨNG TIấU CHẢY Ở LỢN CON DƢỚI 2 THÁNG TUỔI TẠI TỈNH BẮC GIANG 3.1.1. Tỷ lệ lợn con dƣới 2 thỏng tuổi tiờu chảy và chết do tiờu chảy tại một số huyện của tỉnh Bắc Giang
Để đỏnh giỏ tỡnh hỡnh bệnh tiờu chảy ở lợn con theo địa dƣ hành chớnh, chỳng tụi đó tiến hành xỏc định tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết vỡ bệnh tiờu chảy tại 3 huyện: Hiệp Hũa, Tõn Yờn và Việt Yờn. Kết quả điều tra đƣợc thể hiện tại bảng 3.1.
Bảng 3.1. Tỷ lệ lợn con tiờu chảy và chết do tiờu chảy tại một số huyện
Huyện Tổng số lợn điều tra (Con) Tỷ lệ lợn tiờu chảy Lợn chết do tiờu chảy Số lƣợng (con) Tỷ lệ (%) Số lƣợng (con) Tỷ lệ (%) Hiệp Hũa 9.228 3.312 35,89 672 20,29 Tõn Yờn 10.205 3.340 32,73 628 18,80 Việt Yờn 10.247 2.470 24,10 389 15,75 Tớnh chung 29.680 9.122 30,73 1.689 18,52
Bảng 3.1. cho thấy tỷ lệ mắc tiờu chảy chung trờn đàn lợn con là 30,73% và tỷ lệ chết 18,52%. Tỷ lệ lợn con mắc tiờu chảy và chết cú sai khỏc nhau giữa cỏc huyện trong tỉnh, tại Hiệp Hũa tỷ lệ mắc và chết cao nhất (tƣơng ứng 35,89% và 20,29%); thấp nhất là ở Việt Yờn (tƣơng ứng 24,10% và 15,75%). Nguyờn nhõn là chăn nuụi lợn ở Hiệp Hũa chủ yếu nhỏ lẻ theo hộ gia đỡnh, điều kiện chăm súc, nuụi dƣỡng, vệ sinh cũn hạn chế. Kết quả này của chỳng tụi cũng tƣơng đồng với nghiờn cứu tại Thiệu Yờn (Thanh Hoỏ) của Hoàng Văn Tuấn và cs (1998)[70] cho thấy tỷ lệ lợn sau cai sữa bị tiờu
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
chảy là 31,7%; cũn so với nghiờn cứu của Nguyễn Thị Kim Lan và cs (2006b)[25] tại Thỏi Nguyờn với tỷ lệ lợn sau cai sữa tiờu chảy là 13,9% thỡ kết quả nghiờn cứu của chỳng tụi ớt nhiều cú sự sai khỏc. Nhƣ vậy, ở mỗi địa phƣơng khỏc nhau thỡ tỷ lệ lợn bị tiờu chảy cũng khỏc nhau và cú thể đƣợc giải thớch là do mỗi vựng sinh thỏi, mỗi điều kiện chăn nuụi và trỡnh độ ngƣời chăn nuụi khỏc nhau đó ảnh hƣởng đến tỷ lệ mắc tiờu chảy ở lợn vựng đú. Tại cỏc địa phƣơng khi điều kiện chăn nuụi cũn hạn chế, tỷ lệ lợn con mắc bệnh tiờu chảy cao. Ở nghiờn cứu này, chỳng tụi chỉ điều tra tỷ lệ mắc và chết do tiờu chảy trờn lợn con từ 1 ngày tuổi đến 60 ngày tuổi là giai đoạn lợn chịu ảnh hƣởng mạnh nhất của cỏc điều kiện bất lợi nhƣ: Thời tiết, ẩm độ, chuồng nuụi, chăm súc nuụi dƣỡng, tỡnh trạng vệ sinh và đặc biệt khi ỏp dụng cỏc phỏc đồ điều trị bệnh tiờu chảy ở lợn con tại tỉnh Bắc Giang do tớnh khỏng thuốc của vi khuẩn nờn kết quả điều trị rất thấp. Chớnh vỡ vậy, kết quả điều tra của chỳng tụi cú tỷ lệ lợn con mắc và chết do tiờu chảy tƣơng đối cao.
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Hiệp Hũa Tõn Yờn Việt Yờn
Tỷ lệ ( % ) Tỷ lệ lợn tiờu chảy Tỷ lệ lợn chết do tiờu chảy
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Để cú thể đỏnh giỏ kỹ càng hơn sự sai khỏc về tỷ lệ mắc bệnh giữa cỏc địa phƣơng, chỳng tụi đó tiến hành so sỏnh nguy cơ lợn mắc tiờu chảy giữa cỏc huyện bằng phƣơng phỏp phõn tớch dịch tễ.
* Kết quả so sỏnh nguy cơ mắc tiờu chảy ở lợn giữa cỏc huyện, thị đƣợc trỡnh bày tại bảng 3.2.
Bảng 3.2. So sỏnh nguy cơ mắc tiờu chảy ở lợn giữa cỏc huyện Đối tƣợng so sỏnh (huyện) Khụng bệnh (con) Cú bệnh (con) Tỷ suất bệnh (%) χ 2 TN RR
Hiệp Hũa so với Tõn Yờn 5.916 3.312 35,89 21 1,09 6.865 3.340 32,73
Hiệp Hũa so với Việt Yờn 5.916 3.312 35,89 323 1,49