3. í nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
3.2.2. Kết quả phõn lập vi khuẩn E.coli từ cỏc mẫu phõn và phủ tạng
con tiờu chảy tại tỉnh Bắc Giang
Mẫu phõn và mẫu phủ tạng (mỏu tim, gan, lỏch, dịch ruột non) đƣợc lấy từ lợn con tiờu chảy ở 3 huyện Tõn Yờn, Hiệp Hũa, Việt Yờn với tổng số mẫu là 270 mẫu. Mẫu sau khi lấy xong đƣợc bảo quản ở 4oC và đƣợc đem đến bộ mụn vi trựng, Viện Thỳ y để phõn lập và làm cỏc xột nghiệm tiếp theo.
Phõn lập vi khuẩn E.coli thực hiện theo quy trỡnh thƣờng quy của bộ mụn vi trựng, Viện Thỳ y Quốc gia (270 mẫu trong đú cú 150 mẫu phủ tạng và 120 mẫu phõn của lợn con dƣới 2 thỏng tuổi mắc bệnh tiờu chảy). Kết quả đƣợc trỡnh bày ở bảng 3.11.
Bảng 3.11. Kết quả phõn lập vi khuẩn E.coli từ cỏc mẫu phõn và phủ tạng lợn con tiờu chảy (n=270)
Địa điểm thu thập mẫu Mẫu phủ tạng (n=150) Mẫu phõn (n=120) Tổng số mẫu phõn lập Tổng số mẫu dƣơng tớnh Tỷ lệ (%) Số mẫu phõn lập Số mẫu dƣơng tớnh Tỷ lệ (%) Số mẫu phõn lập Số mẫu dƣơng tớnh Tỷ lệ (%) Việt Yờn 50 43 86 40 35 87,50 90 78 86,67 Hiệp Hũa 50 48 96 40 40 100 90 88 97,78 Tõn Yờn 50 45 90 40 37 92,50 90 82 91,11 Tụ̉ng sụ́ 150 136 90,67 120 112 93,33 270 248 91,85
Trong 270 mẫu phõn và phủ tạng đƣợc thu thập từ lợn con tiờu chảy (bảng 3.11) cho thấy vi khuẩn E.coli hiện diện trong hầu hết cỏc mẫu
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
(248/270 mẫu chiếm 91,85%), trong đú, 90,67% là từ cỏc mẫu phủ tạng và 93,33% từ cỏc mẫu phõn. Cũng nhận thấy huyện Hiệp Hũa cú tỷ lệ phõn lập
E.coli từ lợn con bị tiờu chảy là cao nhất (97,78%), thấp hơn là Tõn Yờn (91,11%) và thấp nhất là Việt Yờn (86,67%). Kết quả về tỷ lệ phõn lập đƣợc vi khuẩn E.coli trong nghiờn cứu này là tƣơng đƣơng với cỏc nghiờn cứu của một số tỏc giả trƣớc đõy:
Cự Hữu Phỳ và cs (1999)[41] khi tiến hành phõn lập vi khuẩn E.coli từ cỏc mẫu phõn của lợn từ 35 ngày đến 4 thỏng tuổi bị tiờu chảy, đó xỏc định đƣợc 60/ 70 mẫu cú vi khuẩn E.coli, chiếm tỷ lệ 85,71%.
Trịnh Quang Tuyờn và cs (2004)[71] khi tiến hành phõn lập vi khuẩn
E.coli từ cỏc mẫu phõn của lợn bị tiờu chảy, đó xỏc định đƣợ 259/ 325 mẫu cú vi khuẩn E.coli, chiếm tỷ lệ 79,69%.
Trƣơng Quang (2005)[48] khi phõn lập vi khuẩn E.coli từ cỏc mẫu phõn lợn bị tiờu chảy lấy tại địa bàn Hà Nội, đó cú kết luận 100% mẫu phõn của lơn từ 1- 60 ngày tuổi bị tiờu chảy phõn lập đƣợc E.coli.
Nguyễn Thị Kim Lan (2004)[23] phõn lập E.coli từ cỏc mẫu phõn lợn bị bệnh phự đầu ở 2 tỉnh Bắc Giang và Thỏi Nguyờn, đó thụng bỏo rằng cú 100% mẫu phõn của lợn bị tiờu chảy và phự đầu phõn lập đƣợc vi khuẩn E.coli.
Nguyễn Thị Ngữ (2005)[34] khi nghiờn cứu về vi khuẩn E.coli và
Salmonella trong phõn lợn bị tiờu chảy tại huyện Chƣơng Mỹ- Hà Tõy, đó nhận xột: Cú tới 93,7 - 96,4% số mẫu phõn lập cú E.coli và 75,0 - 78,6% số mẫu phõn lập cú Salmonella.
Đặng Xuõn Bỡnh và cs (2008)[3] khi tiến hành phõn lập vi khuẩn E.coli
từ cỏc mẫu bệnh phẩm lợn con mắc bệnh phõn trắng thu thập tại cỏc tỉnh: Cao Bằng, Thỏi Nguyờn, Hà Tõy, Bắc Ninh, đó xỏc định đƣợc 150/177 mẫu cú vi khuẩn E.coli chiếm tỷ lệ 84,7%.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.2.3. Kờ́t quả giỏm định đặc tớnh sinh học của cỏc chủng vi khuẩn E.coli
phõn lọ̃p đƣợc
Giỏm định đặc tớnh sinh học cỏc chủng vi khuẩn E.coli phõn lập đƣợc nhằm phõn loại và xỏc định đỳng loài, trờn cơ sở đú cú những nghiờn cứu tiếp theo. Sau khi phõn lập đƣợc 248 chủng vi khuẩn E.coli từ mẫu phõn và mẫu phủ tạng của lợn con mắc tiờu chảy, chỳng tụi tiến hành làm cỏc phản ứng sinh hoỏ và kiểm tra khả năng gõy dung huyết của chỳng. Kết quả đƣợc trỡnh bày tại bảng 3.12.
Bảng 3.12. Kờ́t quả giám định đặc tớnh sinh học của cỏc chủng vi khuõ̉n E.coli phõn lọ̃p đƣợc
STT Chỉ tiờu kiểm tra
Vi khuõ̉n E.coli Sụ́ chủng kiểm tra Sụ́ chủng dƣơng tính Tỷ lệ (%) 1 Dung huyờ́t 248 248 100 2 Indol 248 248 100 3 VP 248 0 0 4 Citrat 248 0 0 5 MR 248 248 100 6 Lactose 248 248 100 7 Maltose 248 248 100 8 Xylose 248 248 100 9 Fructose 248 248 100 10 Glucose 248 248 100 11 Inositol 248 0 0 12 D - Raffnose 248 248 100 13 Sobitol 248 248 100
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 3.12 cho chỳng tụi thấy:
- Tất cả cỏc chủng E.coli phõn lập đƣợc (100%) đều cú khả năng gõy dung huyết trờn mụi trƣờng thạch cú bổ sung 5% mỏu cừu. Trƣớc đõy, khả năng dung huyết của của vi khuẩn E.coli đƣợc coi là một yếu tố gõy bệnh quan trọng của vi khuẩn này, nhƣng nhiều nghiờn cứu gần đõy đều đó thống nhất rằng dung huyết chỉ đƣợc xem nhƣ một đặc tớnh sinh hoỏ học của vi khuẩn E.coli.
- 100% cỏc chủng E.coli đƣợc kiểm tra cho phản ứng sinh Indol và MR dƣơng tớnh, cũn cỏc phản ứng VP và Citrat thỡ đều cho kết quả õm tớnh. Tỷ lệ cỏc chủng lờn men đƣờng Lactose, Maltose, Mannitol, Mannose, Sorbitol, Xylose là 100%. Riờng với đƣờng Inositol, tất cả chủng đều cho kết quả õm tớnh.
So sỏnh kết quả giỏm định đặc tớnh sinh hoỏ của 248 chủng vi khuẩn
E.coli phõn lập đƣợc với bảng sinh hoỏ chuẩn của loại vi khuẩn này thỡ thấy cỏc chủng vi khuẩn E.coli phõn lập đƣợc từ lợn con tiờu chảy tại tỉnh Bắc Giang đều cú cỏc đặc điểm chung, rất điển hỡnh của vi khuẩn E.coli nhƣ đó đƣợc cỏc tài liệu trong và ngoài nƣớc mụ tả.
3.2.4. Kờ́t quả xác định serotype kháng nguy ờn O của các chủng vi khuõ̉n
E.coli phõn lọ̃p đƣợc
Chỳng tụi đó xỏc định serotype khỏng nguyờn O của 248 chủng vi khuẩn E.coli bằng phản ứng ngƣng kết nhanh trờn phiến kớnh. Kết quả đƣợc trỡnh bày ở bảng 3.13.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 3.13. Kờ́t quả xác định serotype kháng nguyờn O của các chủng vi khuõ̉n E.coli phõn lọ̃p đƣợc
Địa điểm (huyện)
Số chủng kiểm tra
Serotype khỏng nguyờn 0
O8 O138 O139 O141 O149 O111
n (+) Tỷ lệ (%) n (+) Tỷ lệ (%) n (+) Tỷ lệ (%) n (+) Tỷ lệ (%) n (+) Tỷ lệ (%) n(+) Tỷ lệ (%) Hiệp Hũa 88 9 10,23 8 9,09 11 12,50 32 36,36 31 35,22 6 6,81 Tõn Yờn 82 7 8,54 7 8,54 15 18,29 21 25,60 29 35,37 9 10,97 Việt Yờn 78 5 6,41 9 11,54 14 17,95 15 19,23 18 23,08 17 21,79 Tổng 248 21 8,47 24 9,68 40 16,13 68 27,42 78 31,45 32 12,90 77
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Trong 248 chủng E.coli đƣợc kiểm tra (Bảng 3.13) đều cho kết quả dƣơng tớnh với 1 trong 6 serotype khỏng huyết thanh O. Trong đú cỏc chủng thuộc serotyp O149 chiếm tỷ lệ cao nhất (31,45%); thấp hơn là cỏc chủng thuộc serotyp O141 (27,42%). Cỏc serotype O139, O111 và O138 lần lƣợt cú tỷ lệ tƣơng ứng là 16,13%; 12,90% và 9,68%; serotype O8 chiếm tỷ lệ thấp nhất (8,47%). Kết quả xỏc định serotype khỏng nguyờn O của chỳng tụi cũng phự hợp với một số nghiờn cứu đó tiến hành trƣớc đõy, phần lớn cỏc tỏc giả đều cho thấy serotype khỏng nguyờn O149 chiếm tỷ lệ cao và là serotype chớnh gõy bệnh ở lợn con sau cai sữa.
Theo Fairbrother (1992)[84] cỏc serotype O138, O139, O141 và O149 thuộc nhúm VK ETEC và VTEC là cỏc nhúm thƣờng hay gặp gõy tiờu chảy cho lợn con sau cai sữa.
Tất giả Vũ Khắc Hựng và cs (2004)[21] khi xỏc định serotype khỏng nguyờn O của cỏc chủng E.coli phõn lập từ lợn con bị tiờu chảy ở Cộng hoà Slovakia lại thấy rằng Serotype O149 chiếm tỷ lệ cao nhất (77%) trong tổng số 220 chủng vi khuẩn đƣợc kiểm tra, serotype O2, O15, O101 và O157 cú cựng tỷ lệ là 1,8%, cũn lại cỏc serotype O8, O54, O84, O147 chiếm cỏc tỷ lệ tƣơng ứng là 6,3%; 2,2%; 2,7%; 2,2%.
Cũng xỏc định serotype khỏng nguyờn O của cỏc chủng E.coli phõn lập đƣợc ở lợn sau cai sữa ở những địa điểm lấy mẫu khỏc nhau thuộc khu vực đồng bằng sụng Cửu Long, Nguyễn Khả Ngự (2000)[35] cho biết, trong số 11 serotype đƣợc xỏc định, O26 chiếm tỷ lệ cao nhất 27,8%, tiếp theo là O139 chiếm tỷ lệ 13,9%, cỏc serotype O127, O111, O124, O125, O126, O86, O149 đều chiếm tỷ lệ 8,3%, cũn serotype O55, O128 chỉ chiếm tỷ lệ 2,8%. Kết quả của tỏc giả Nguyễn Khả Ngự ớt nhiều cú sự sai khỏc với cỏc kết quả của nghiờn cứu này, vỡ cỏc mẫu đƣợc điều tra trong nghiờn cứu của Nguyễn Khả Ngự cú nguồn gốc là lợn mắc bệnh phự đầu, cũn trong nghiờn cứu này là mẫu đƣợc lấy từ cỏc lợn từ 1- 60 ngày tuổi bị mắc bệnh tiờu chảy.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Ở tỉnh Tiền Giang, cỏc tỏc giả Bựi Trung Trực và cs (2004)[69] lại thấy cỏc serotype O8, O64, O142, O138 và O139 là phổ biến, trong đú O139 chiếm tỷ lệ cao nhất. Tỏc giả cũng đó suy luận là đàn lợn ở tỉnh Tiền Giang cơ nguy cơ mắc bệnh phự đầu.
Theo thống kờ của cỏc nhà nghiờn cứu nƣớc ngoài thỡ cỏc chủng vi khuẩn
E.coli thuộc nhúm huyết thanh O139 và cú mang khỏng nguyờn bỏm dớnh F18 chủ yếu gõy tiờu chảy cho lợn sau cai sữa ở Úc, cũn ở Chõu Âu thỡ đại đa số cỏc chủng vi khuẩn cú cấu trỳc khỏng nguyờn đú lại gõy bệnh phự đầu.
Nhƣ vậy, cỏc serotype khỏng nguyờn O của cỏc chủng vi khuẩn E.coli
gõy bệnh cho lợn tỡm thấy cú sự sai khỏc ở cỏc vựng với cỏc vị trớ địa lý khỏc nhau, thƣờng gắn liền với loại bệnh và độ tuổi khỏc nhau của lợn.
0 5 10 15 20 25 30 35 Serotype T Ỉ lệ % O8 O138 O139 O141 O149 O111
Hỡnh 3.5. Biểu đồ kết quả xỏc định serotype khỏng nguyờn O của cỏc chủng vi khuẩn E.coli phõn lập đƣợc
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.2.5. Kết quả xỏc định cỏc yếu tố gõy bệnh của cỏc chủng vi khuẩn E.coli
phõn lập đƣợc
Trong cỏc chủng vi khuẩn E.coli đó đƣợc xỏc định serotype khỏng nguyờn O, chỳng tụi chọn ra 30 chủng với cỏc đặc điểm điển hỡnh đại diện cho cỏc serotype, cỏc địa điểm lấy mẫu để xỏc định cỏc yếu tố gõy bệnh bao gồm: Cỏc yếu tố bỏm dớnh F4, F5, F6, F18 và độc tố chịu nhiệt STa, STb, độc tố khụng chịu nhiệt LT và độc tố verotoxin VT2e đó đƣợc xỏc định bằng phản ứng PCR. Kết quả đƣợc trỡnh bày ở bảng 3.14.
Bảng 3.14. Tỷ lệ cỏc chủng vi khuẩn E.coli mang cỏc gen quy định sinh tổng hợp cỏc yếu tố gõy bệnh
Cỏc yếu tố gõy bệnh
Số chủng vi khuẩn
E.coli kiểm tra
Số chủng vi khuẩn E.coli dƣơng tớnh Tỷ lệ (%) Yếu tố bỏm dớnh F4 30 12 40,0 F5 30 2 6,67 F6 30 5 16,67 F18 30 7 23,33 Độc tố STa 30 19 63,33 STb 30 11 36,67 LT 30 22 73,33 VT2e 30 9 30,0
Kết quả cho thấy cỏc gen quy định sinh tổng hợp 4 loại yếu tố bỏm dớnh (F4, F5, F6 và F18) và 4 loại độc tố (STa, STb, LT và VT2e) đều đó đƣợc phỏt hiện thấy trong 30 chủng vi khuẩn E.coli phõn lập đƣợc.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Sử dụng PCR để xác định yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E.coli phân lập đ-ợc
- Cú 26/ 30 chủng (chiếm 86,67%) mang yếu tố bỏm dớnh, cao hơn so với 4/30 chủng (chiếm 13,33%) khụng mang yếu tố bỏm dớnh. Kết quả này hoàn toàn phự hợp với kết quả của Do và cs (2006)[82] khi tiến hành một nghiờn cứu tƣơng tự với 85 chủng vi khuẩn E.coli thu thập đƣợc từ một số tỉnh của miền Bắc đó kết luận: Cú 94,1% số chủng mang khỏng yếu tố dớnh (F4 hoặc F18) và 5,9% số chủng khụng mang yếu tố bỏm dớnh.
- Trong 4 loại yếu tố bỏm dớnh, số chủng mang yếu tố F4 chiếm tỷ lệ cao nhất (40,0%), tiếp đến số chủng mang yếu tố F18 (23,33%), số chủng mang yếu tố F6 (16,67%) và ớt nhất là số chủng mang yếu tố F5 (6,67%). So với kết quả nghiờn cứu của Vừ Thành Thỡn và cs (2009)[63] thụng bỏo tỷ lệ cỏc chủng vi khuẩn E.coli phõn lập từ lợn con mắc bệnh tiờu chảy tại một số tỉnh Nam Trung bộ và Tõy Nguyờn mang yếu tố bỏm dớnh F18 là 44,02%, F4 là 29,89% thỡ kết quả của chỳng tụi đó cú sự sai khỏc. Nhƣ vậy tại cỏc địa phƣơng khỏc nhau kết quả xỏc định yếu tố bỏm dớnh của vi khuẩn E.coli cũng đó khỏc nhau.
- Trong cỏc loại độc tố, số chủng mang độc tố LT chiếm tỷ lệ cao nhất (73,33%), tiếp theo là độc tố STa (63,33%) và STb (36,67%), thấp nhất là VT2e (30%); kết quả này phần lớn phự hợp với cỏc nghiờn cứu trƣớc đú.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Đỗ Ngọc Thỳy và cs (2007)[67] khi nghiờn cứu về tổ hợp gen của một số yếu tố gõy bệnh cú trong cỏc chủng vi khuẩn E.coli gõy bệnh tiờu chảy cho lợn sau cai sũa tại tỉnh Phỳ Thọ đó cú kết luận: 4 loại độc tố (STa, STb, LT và VT2e) đều đó đƣợc phỏt hiện thấy trong số cỏc chủng E.coli phõn lập đƣợc. Trong đú, số chủng mang độc tố VT2e chiếm tỷ lệ cao nhất (78,3%), tiếp theo là độc tố LT (69,6%) và STa (65,2%), thấp nhất là STb (21,7%).
Đặng Xuõn Bỡnh và cs (2008)[3] cho biết cỏc chủng vi khuẩn E.coli phõn lập đƣợc từ bệnh phẩm lợn con theo mẹ mắc bệnh phõn trắng tại Thỏi Nguyờn, Cao Bằng, Hà Tõy, Bắc Ninh sản sinh độc tố đƣờng ruột ST (46,8%), LT (37,5%), ST+LT(15,6%).
Tuy nhiờn kết quả của chỳng tụi ớt nhiều cú sự sai khỏc về chủng loại, tỷ lệ sản sinh cỏc loại độc tố của cỏc vi khuẩn E.coli, sở dĩ cú sự sai khỏc là do cỏc nghiờn cứu đƣợc thực hiện ở cỏc vựng với cỏc vị trớ địa lý khỏc nhau, thƣờng gắn liền với loại bệnh và độ tuổi khỏc nhau của lợn.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 T ỷ lệ (% ) F4 F5 F6 F18 Sta STb LT VT2e
Hỡnh 3.6. Biểu đồ tỷ lệ cỏc chủng vi khuẩn E.coli mang cỏc gen quy định sinh tổng hợp cỏc yếu tố gõy bệnh
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.2.6. Kờ́t quả kiờ̉m tra đụ̣c lƣ̣c của mụ̣t sụ́ chủng vi khuõ̉n E.coli trờn chuụ̣t bạch chuụ̣t bạch
Việc xỏc định độc lực của vi khuẩn E.coli phõn lập đƣợc, trờn động vật thớ nghiệm (chuột bạch) là một trong cỏc tiờu chớ quan trọng để đỏnh giỏ khả năng gõy bệnh của chỳng. Từ kết quả nghiờn cứu về đặc tớnh, hỡnh thỏi, nuụi cấy, tớnh chất sinh vật húa học của cỏc chủng vi khuẩn E.coli phõn lập đƣợc từ cỏc mẫu bệnh phẩm lợn con dƣới 2 thỏng tuổi mắc bệnh tiờu chảy, chỳng tụi chọn 18 chủng vi khuẩn E.coli cú cỏc đặc tớnh sinh vật, húa học điển hỡnh cho cỏc serotype và cỏc yếu tố gõy bệnh để kiểm tra độc lực qua chuột bạch. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.15.
Qua bảng 3.15 cho thấy cỏc chủng vi khuẩn E.coli phõn lập đƣợc từ lợn con dƣới 2 thỏng tuổi ở Bắc Giang cú độc lực mạnh và là nguyờn nhõn quan trọng trong hội chứng tiờu chảy ở lợn. Trong tổng số 18 chủng E.coli khi tiờm cho chuột bạch, cú 32 chuột chết sau tiờm trong vũng 48 giờ (88,89%); 14 chủng E.coli gõy chết 100% chuột thớ nghiệm trong vũng 12-48 giờ (77,78%). Đỏng lƣu ý là 5 chủng E-BG 125, E-BG 117, E-BG 55, E-BG 17 và E-BG 15 cú độc lực rất mạnh, gõy chết 100% chuột trong vũng 12 giờ và 7 chủng gõy chết 50-100% chuột trong vũng 24 giờ sau tiờm. Cỏc chuột chết đƣợc mổ khỏm đều cú bệnh tớch điển hỡnh (bụng chƣớng to, viờm phổi, gan sƣng, tụ huyết, ruột xuất huyết, tim nhóo). Lấy mỏu tim ria cấy trờn thạch mỏu và MacConkey thỡ đều phõn lập lại đƣợc E.coli. Kết quả của chỳng tụi cũng tƣơng đồng với kết quả của một số tỏc giả nhƣ Hồ Soỏi và cs (2005)[49] đó kiểm tra độc lực 5 chủng E.coli phõn lập từ phõn lợn bị tiờu chảy ở Quảng Trị cho thấy 4 chủng gõy chết 100% và 1 chủng gõy chết 50% chuột đƣợc tiờm; Trƣơng Quang (2005)[48] đó kiểm tra độc lực của 30 chủng E.coli phõn lập