3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
2.4.2. Bố trí theo dõi sự ô nhiễm Oocyst cầutrùng bê,nghé ở chuồng nuôi,
khu vực xung quanh chuồng nuôi bê, nghé
* Phương pháp bố trí theo dõi
Lấy mẫu theo sơ đồ sau:
Địa phƣơng (huyện, xã) Mẫu nền chuồng Mẫu đất xung quanh chuồng Phú Lƣơng 31 26 Phấn Mễ 13 9 Tức Tranh 7 7 Cổ Lũng 11 10 Phú Bình 37 25 Lƣơng Phú 10 9 Đào Xá 14 8 Tân Kim 13 8 Phổ Yên 32 24 Hồng Tiến 11 8 Đồng Tiến 9 9 Tiên Phong 12 7 Tính chung 98 75
Phương pháp thu thập mẫu
- Mẫu đất hoặc cặn nền chuồng nuôi bê, nghé: tại mỗi ô chuồng, lấy mẫu đất (cặn) ở 4 góc chuồng, trộn đều đƣợc một mẫu xét nghiệm (khoảng 100 gam/mẫu). Mỗi mẫu đƣợc để riêng trong túi nilon có nhãn ghi: loại mẫu, địa điểm và thời gian lấy mẫu.
- Mẫu đất bề mặt khu vực xung quanh chuồng: lấy mẫu đất bề mặt tƣơng tự nhƣ cách lấy mẫu nền chuồng.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
* Phương pháp xét nghiệm mẫu: Xét nghiệm các loại mẫu trên bằng phƣơng pháp Darling để phát hiện Oocyst cầu trùng.
2.4.3. Nghiên cứu sức đề kháng của Oocyst cầu trùng bê, nghé
2.4.3.1. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các mức nhiệt độ đến khả năng sống của Oocyst cầu trùng
* Ảnh hưởng của các mức nhiệt độ đến khả năng sống của Oocysst cầu trùng bê nghé mới theo phân ra ngoại cảnh
- Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí 4 lần ở 4 mức nhiệt độ khác nhau: 350C, 400C, 450C, 500C. Mỗi lần thí nghiệm đƣợc bố trí ở 10 đĩa petri có đƣờng kính 30 cm có chứa 1.000 – 5.000 Oocyst.
- Phƣơng pháp theo dõi và xác định sự tồn tại của Oocyst mới theo phân ra ngoại cảnh ở các mức nhiệt độ khác nhau:
Thu nhận Oocyst cầu trùng từ các mẫu phân bê nghé mới thải cho vào các đĩa petri sạch. Đƣa đĩa petri lên kính hiển vi quan sát và đếm số Oocyst. Điều chỉnh mức nhiệt độ tủ ấm trong từng lần thí nghiệm và đặt các đĩa petri có chứa Oocyst cầu trùng vào tủ ấm. Cứ sau 1 giờ lấy đĩa ra kiểm tra để theo dõi sự thay đổi về hình thái, lớp vỏ, nguyên sinh chất của Oocyst cầu trùng trên kính hiển vi. Đếm tổng số Oocyst/3 vi trƣờng và số Oocyst chết. Từ đó xác định đƣợc tỷ lệ và thời gian Oocyst chết.
* Ảnh hưởng của các mức nhiệt độ đến khả năng sống của Oocyst cầu trùng bê nghé có sức gây bệnh
- Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí 4 lần ở 4 mức nhiệt độ khác nhau: 350C, 400C, 450C, 500C. Mỗi lần thí nghiệm đƣợc bố trí ở 10 đĩa petri có đƣờng kính 30 cm có chứa 1.000 – 5.000 Oocyst.
- Phƣơng pháp theo dõi và xác định sự tồn tại của Oocyst có sức gây bệnh ở các mức nhiệt độ khác nhau:
Thu nhận Oocyst cầu trùng đã phát triển thành Oocyst có sức gây bệnh từ dung dịch nuôi cấy Bichromate kali 2,5% vào các đĩa petri sạch. Đƣa đĩa
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
petri lên kính hiển vi quan sát và đếm số Oocyst. Điều chỉnh mức nhiệt độ tủ ấm trong từng lần thí nghiệm và đặt các đĩa petri có chứa Oocyst cầu trùng vào tủ ấm. Cứ sau 1 giờ lấy đĩa ra kiểm tra để theo dõi hình thái, màu sắc, sự biến đổi của Oocyst cầu trùng trên kính hiển vi. Đếm tổng số Oocyst/3 vi trƣờng và số Oocyst chết. Từ đó xác định đƣợc tỷ lệ và thời gian Oocyst chết.
2.4.3.2. Ảnh hưởng của chất sát trùng đến khả năng sống của Oocyst cầu trùng
* Ảnh hưởng của chất sát trùng đến khả năng phát triển của Oocyst cầu trùng bê nghé mới theo phân ra ngoại cảnh
- Bố trí thí nghiệm: chia 3 lô thí nghiệm:
+ Lô 1: 10 đĩa petri có chứa Oocyst mới theo phân ra ngoại cảnh đƣợc thu thập từ các mẫu phân bê nghé; mỗi đĩa có chứa 1.000 – 5.000 Oocyst. Sử dụng thuốc sát trùng Povidine 10% phun trực tiếp lên mặt đĩa petri.
+ Lô 2: bố trí nhƣ lô 1, chỉ khác là sử dụng thuốc sát trùng Han – Iodine 10%.
+ Lô 3: bố trí nhƣ lô 1, chỉ khác là sử dụng thuốc sát trùng Benkocid 5%.
Thí nghiệm đƣợc lặp lại 2 lần.
- Phƣơng pháp kiểm tra và xác định sự phát triển của Oocyst cầu trùng Cứ 1 giờ lại đƣa đĩa petri đã đƣợc phun thuốc sát trùng lên kính hiển vi quan sát và theo dõi hình thái, màu sắc và sự biến đổi của Oocyst cầu trùng. Đếm tổng số Oocyst/3 vi trƣờng và số Oocyst chết. Từ đó xác định đƣợc tỷ lệ và thời gian Oocyst chết.
* Ảnh hưởng của chất sát trùng đến khả năng phát triển của Oocysst cầu trùng bê nghé có sức gây bệnh
- Bố trí thí nghiệm: chia 3 lô thí nghiệm:
+ Lô 1: 10 đĩa petri có chứa Oocyst có sức gây bệnh đƣợc thu nhận từ dung dịch Bichromate kali 2,5%; mỗi đĩa có chứa 1.000 – 5.000 Oocyst. Sử dụng thuốc sát trùng Povidine 10% phun trực tiếp lên mặt đĩa petri.
+ Lô 2: bố trí nhƣ lô 1, chỉ khác là sử dụng thuốc sát trùng Han – Iodine 10%.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
+ Lô 3: bố trí nhƣ lô 1, chỉ khác là sử dụng thuốc sát trùng Benkocid 5%.
Thí nghiệm đƣợc lặp lại 2 lần.
- Phƣơng pháp kiểm tra và xác định sự phát triển của Oocyst cầu trùng Cứ 1 giờ lại đƣa đĩa petri đã đƣợc phun thuốc sát trùng lên kính hiển vi quan sát và theo dõi hình thái, màu sắc và sự biến đổi của Oocyst cầu trùng. Đếm tổng số Oocyst/3 vi trƣờng và số Oocyst chết. Từ đó xác định đƣợc tỷ lệ và thời gian Oocyst chết.
2.4.4. Phƣơng pháp nghiên cứu đặc điểm bệnh lý, lâm sàng của bệnh cầutrùng bê, nghé cầutrùng bê, nghé
2.4.4.1. Phương pháp theo dõi biểu hiện lâm sàng chủ yếu của bê, nghé bị bệnh cầu trùng
* Phương pháp bố trí
Trong quá trình xét nghiệm phân, đã phát hiện đƣợc những bê, nghé nhiễm cầu trùng. Chọn những bê, nghé chỉ nhiễm cầu trùng, không nhiễm bất cứ loại giun sán và bệnh truyền nhiễm nào khác, theo dõi các biểu hiện lâm sàng của những bê, nghé này.
* Phương pháp theo dõi
Sử dụng các phƣơng pháp chẩn đoán lâm sàng nhƣ: đo thân nhiệt bằng nhiệt kế 430C, quan sát thể trạng, lông, da; quan sát màu sắc các niêm mạc; theo dõi màu sắc, trạng thái và mùi phân, số lần đi ỉa trong ngày; tình trạng ăn uống....
2.4.4.2. Phương pháp xét nghiệm máu của nghé bị bệnh cầu trùng và nghé khỏe * Bố trí xét nghiệm máu nghé
Tiến hành hai đợt xét nghiệm máu của hai nhóm nghé. Một nhóm gồm những nghé nhiễm cầu trùng với mức độ nặng. Nhóm kia là nghé khoẻ.
Lấy mẫu máu của nghé khỏe và nghé bị bệnh cầu trùng ở tĩnh mạch cổ (1ml/con) cho vào ống nghiệm có tráng chất chống đông máu. Bố trí thí nghiệm theo sơ đồ sau:
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Nghé nhiễm cầu trùng Nghé khỏe
Số con Số mẫu máu Số con Số mẫu máu
3 nghé 6 3 nghé 6
* Phương pháp xác định
Xác định số lƣợng hồng cầu, số lƣợng bạch cầu, hàm lƣợng huyết sắc tố bằng máy ABX Micros tại khoa huyết học - Bệnh viện Đa khoa Trung ƣơng.
Công thức bạch cầu đƣợc xác định bằng phƣơng pháp Tristova: làm tiêu bản máu, nhuộm Giemsa, đếm số lƣợng từng loại bạch cầu và tính tỷ lệ phần trăm từng loại.
2.4.5. Nghiên cứu biện pháp phòng, trị cầu trùng cho bê, nghé
2.4.5.1. Bố trí thí nghiệm xác định công thức ủ phân có khả năng sinh nhiệt tốt để diệt Oocyst cầu trùng nhiệt tốt để diệt Oocyst cầu trùng
Chúng tôi đã thực hiện thí nghiệm với 3 công thức ủ, nhằm lựa chọn đƣợc một công thức có khả năng sinh nhiệt tốt nhất.
* Phương pháp bố trí thí nghiệm
- Chuẩn bị nguyên liệu ủ, bố trí ủ theo 3 công thức sau:
Công thức 1: Các nguyên liệu ủ đƣợc chuẩn bị theo tỷ lệ: + Phân chuồng: 800 - 1000 kg.
+ Lá xanh băm nhỏ: 200 kg. + Tro bếp: 60 kg.
Công thức 2: Các nguyên liệu ủ đƣợc bố trí theo tỷ lệ: + Phân chuồng: 800 - 1000 kg.
+ Lá xanh băm nhỏ: 200 kg. + Vôi bột: 20 kg.
Công thức 3: Các nguyên liệu ủ đƣợc bố trí theo tỷ lệ: + Phân chuồng: 800 - 1000 kg.
+ Lá xanh băm nhỏ: 200 kg. + Tro bếp: 60 kg.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
(Theo tài liệu của Trịnh Văn Thịnh và cs (1982) [39], Phạm Văn Khuê và cs (1996) [11], Nguyễn Thị Kim Lan (2012) [17]).
- Cách ủ phân: Trộn đều các nguyên liệu theo tỷ lệ của mỗi công thức ủ, cho vào mỗi bao nilon 20 kg hỗn hợp nguyên liệu đã trộn của mỗi công thức trên.
Cũng trộn đều 5 kg phân của bê, nghé nhiễm cầu trùng nặng với các nguyên liệu khác (lá xanh băm nhỏ, tro bếp, vôi bột) theo tỷ lệ nhƣ 3 công thức, sau đó chia vào các túi vải nhỏ (mỗi túi 10 - 15 g), đặt vào trong các bao phân ủ (ở các vị trí khác nhau). Buộc miệng bao để tạo môi trƣờng yếm khí trong bao.
* Phương pháp theo dõi khả năng sinh nhiệt và tác dụng diệt Oocyst của 3 công thức ủ
Hàng ngày theo dõi nhiệt độ phân ủ, đồng thời lấy từ mỗi bao 1 túi vải để xét nghiệm Oocyst cầu trùng. Từ đó xác định đƣợc khả năng sinh nhiệt của mỗi công thức ủ và tác dụng diệt Oocyst cầu trùng bê, nghé.
2.4.5.2. Phương pháp nghiên cứu lựa chọn thuốc điều trị cầu trùng cho bê nghé
Lựa chọn 4 loại thuốc thƣờng dùng để điều trị bệnh cầu trùng cho nghé. Dự kiến mỗi loại thuốc đƣợc dùng cho 8 nghé có cùng lứa tuổi, mức độ nhiễm và biểu hiện lâm sàng. Sau 5, 10, 15 ngày dùng thuốc, xét nghiệm phân kiểm tra số Oocyst/g phân để đánh giá hiệu lực điều trị của từng loại thuốc. Từ đó, lựa chọn 2 thuốc có hiệu lực tẩy cao nhất và thời gian tẩy sạch Oocyst cầu trùng sớm nhất.
Thử nghiệm thuốc trị cầu trùng với nghé đƣợc thực hiện ở những nghé nhiễm cầu trùng cƣờng độ từ trung bình đến rất nặng (qua xét nghiệm phân) ở 3 huyện theo sơ đồ sau:
Lô thí nghiệm Tên thuốc, liều lƣợng Số nghé dùng thuốc (con) Thời gian xét nghiệm phân (ngày)
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
(30 mg/kg TT)
Lô II RTD-Coccistop
(136 mg/kg TT) 8 Ngày thứ 5, 10,15
Lô III Nova-coc 5%
(25 mg/kg TT) 8 Ngày thứ 5, 10,15
Lô IV Baycox 5% 8 Ngày thứ 5, 10,15
2.4.5.3. Thử nghiệm thuốc điều trị bệnh cầu trùng có hiệu lực cao cho nghé
Từ kết quả nghiên cứu lựa chọn thuốc điều trị bệnh cầu trùng cho nghé, kết hợp với việc theo dõi những biểu hiện lâm sàng chủ yếu của nghé bị bệnh lựa chọn 02 thuốc điều trị phù hợp.
Thử nghiệm 2 thuốc điều trị cho 2 nhóm nghé bị bệnh cầu trùng ở cƣờng độ từ nhẹ đến rất nặng (dự kiến mỗi nhóm 20 nghé). Sau 15 ngày sử dụng phác đồ điều trị tiến hành xét nghiệm phân kiểm tra số Oocyst/g phân và theo dõi các biểu hiện khác của nghé.
2.4.5.4. Phương pháp xác định khối lượng nghé để tính liều lượng thuốc
Dùng cân xác định khối lƣợng những nghé nhỏ để tính liều lƣợng thuốc, với những nghé có khối lƣợng lớn thì xác định khối lƣợng bằng cách đo và tính theo công thức:
- Nghé: KL (kg) = 88,4 x (vòng ngực)2 x dài thân chéo (m).
2.4.5.5. Phương pháp đánh giá hiệu lực của thuốc trị cầu trùng bê, nghé
Trƣớc khi dùng thuốc, xác định cƣờng độ nhiễm bằng cách đếm số lƣợng Oocyst/g phân. Sau khi dùng thuốc 15 ngày, xác định hiệu lực thuốc bằng phƣơng pháp xét nghiệm lại phân bê, nghé tìm Oocyst và đếm số
Oocyst/g phân. Nếu không thấy Oocyst trong phân thì đánh giá thuốc có hiệu lực triệt để với cầu trùng; nếu vẫn thấy Oocyst trong phân nhƣng số lƣợng
Oocyst/g phân giảm rõ rệt thì đánh giá thuốc có hiệu lực với cầu trùng nhƣng chƣa triệt để; nếu thấy số lƣợng Oocyst/g phân vẫn không giảm so với trƣớc khi dùng thuốc hoặc giảm không đáng kể thì đánh giá thuốc không có hiệu lực với cầu trùng.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
2.4.5.6. Phương pháp xác định độ an toàn của thuốc
Độ an toàn của thuốc đƣợc đánh giá bằng kết quả theo dõi trạng thái cơ thể, sự vận động, ăn uống và một số chỉ tiêu sinh lý (thân nhiệt, nhịp thở) của nghé trƣớc và sau khi dùng thuốc 1 giờ.
an toàn.
2.4.5.7. Đề xuất quy trình phòng trừ tổng hợp bệnh cầu trùng bê, nghé
Từ kết quả thu đƣợc về một số đặc điểm dịch tễ và kết quả thử nghiệm thuốc trị cầu trùng, kết quả xác định công thức ủ phân phù hợp, đề xuất quy trình phòng trừ tổng hợp bệnh cầu trùng cho bê, nghé.
2.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Số liệu thu đƣợc đƣợc xử lý bằng phƣơng pháp thống kê sinh học (Nguyễn Văn Thiện, 1997) [37], trên phần mềm Excel 2003 và phần mềm Minitab 14.0.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Các loài cầu trùng ký sinh ở bê, nghé tại tỉnh Thái Nguyên
Bảng 3.1. Các loài cầu trùng ký sinh ở bê, nghé tại tỉnh Thái Nguyên
Ký hiệu loại Oocyst Số Oocyst theo dõi Kích thƣớc Oocyst ( m) Hình thái và màu sắc Thời gian phát triển thành Oocyst gây bệnh (ngày) Kết luận loài cầu trùng Chiều dài (x± mx) Chiều rộng (x± mx) O1 10 18,23 1,27 14,28 0,47 Hình trứng, có 1 - 2 lớp vỏ, màu vàng nhạt. 4 - 5 E. alabamensis (Christiensen, 1941) O2 10 27,27 1,06 18,90 1,13 Hình trứng hoặc không đối xứng, có 2
lớp vỏ, màu nâu hay hơi vàng, không có hạt cực, lỗ noãn ở đầu hẹp. 2 - 3 E. bovis (Christiensen, 1941) O3 10 23,24 0,60 15,07 0,45 Hình e líp hoặc bầu dục, có 1 - 2 lớp vỏ, màu phớt hồng hoặc
không màu, không có hạt cực. 2 - 3 E. ellipsoidalis (Becker, Frye, 1929) O4 10 19,22 0,84 14,93 0,48 Hình trứng hoặc hình cầu, có 2 lớp vỏ, màu nâu nhạt hoặc không màu, không
có hạt cực.
2 - 3
E. zuernii
(Rivolta, 1878, Martin, 1909)
Kết quả bảng 3.1 cho thấy, bê, nghé nuôi tại 3 huyện của tỉnh Thái Nguyên nhiễm 4 loài cầu trùng. Căn cứ vào đặc điểm hình thái, kích thƣớc,
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
màu sắc của Oocyst và thời gian hình thành bào tử, chúng tôi có nhận xét và kết luận nhƣ sau:
- Loại O1: có kích thƣớc 18,23 x 14,28 µm, thời gian phát triển thành
Oocyst có sức gây bệnh là 4 - 5 ngày, Oocyst gây bệnh có 4 túi bào từ, trong mỗi túi bào tử có 2 bào tử con. Theo Christiensen (1941), loài Eimeria alabamemsis có kích thƣớc 13 - 24 x 11 - 16 µm, thời gian hình thành bào tử 4 - 5 ngày. Vì vậy, chúng tôi kết luận O1 chính là loài Eimeria alabamemsis.
- Loại O2: có kích thƣớc 27,27 x 18,90 µm, thời gian phát triển thành
Oocyst có sức gây bệnh là 2 - 3 ngày, Oocyst gây bệnh có 4 túi bào tử, trong mỗi tử túi bào tử có 2 bào tử con. Theo Christiensen (1941), loài Eimeria bovis có kích thƣớc 23 - 34 x 17 - 23 µm, thời gian hình thành bào tử 2 - 3 ngày nên chúng tôi kết luận loài O2 chính là Eimeria bovis.
- Loại O3: có kích thƣớc 23,24 x 15,07 µm, thời gian phát triển thành
Oocyst gây bệnh là 2 - 3 ngày, Oocyst gây bệnh có 4 túi bào tử, trong mỗi túi bào tử có 2 bào tử con. Theo Becker and Frye (1929), loài Eimeria ellipsoidalis có kích thƣớc 9 - 16 x 7 - 15 µm, thời gian hình thành bào tử 2 - 3 ngày. Từ đó, chúng tôi kết luận O3 chính là loài Eimeria ellipsoidalis.
- Loại O4: kích thƣớc 19,22 x 14,93 µm, thời gian phát triển thành
Oocyst có sức gây bệnh là 2 - 3 ngày, Oocyst gây bệnh có 4 túi bào tử, trong mỗi túi bào tử có 2 bào tử con. Theo Rivolta (1978) và Martin (1909), loài
Eimeria zuernii có kích thƣớc 15 - 22 x 13 - 18 µm, thời gian hình thành bào tử 2 - 3 ngày. Nên chúng tôi kết luận O4 chính là loài Eimeria zuernii.
Qua kết quả bảng 3.1 và những vấn đề thảo luận ở trên, chúng tôi có nhận xét: bê, nghé nuôi ở tỉnh Thái Nguyên nhiễm 4 loài cầu trùng: E. alabamensis, E. bovis, E. ellipsoidalis, E. zuernii. Cả 4 loài trên thuộc giống