3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
2.4.1.1. Bố trí thu thập mẫu phân
Bố trí thu thập mẫu theo phƣơng pháp lấy mẫu chùm nhiều bậc, thu thập và xét nghiệm phân của 368 bê, nghé dƣới 1 năm tuổi tại 3 huyện của tỉnh Thái Nguyên
Việc thu thập, xét nghiệm mẫu phân bê, nghé ở 3 huyện đƣợc bố trí cụ thể nhƣ sau:
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Địa phƣơng
(huyện, xã)
Số bê, nghé xét nghiệm phân
(con) Phú Lƣơng Phấn Mễ 42 Tức Tranh 35 Cổ Lũng 43 Phú Bình Lƣơng Phú 43 Đào Xá 41 Tân Kim 45 Phổ Yên Hồng Tiến 41 Đồng Tiến 38 Tiên Phong 40 Tính chung 368
* Phương pháp lấy mẫu, xét nghiệm và đánh giá cường độ nhiễm cầu trùng
- Phƣơng pháp thu thập mẫu: Lấy mẫu theo phƣơng pháp lấy mẫu chùm nhiều bậc.
Mẫu phân: Thu thập ngẫu nhiên ở bê, nghé nuôi ở nông hộ chăn nuôi trâu bò tại các địa phƣơng. Lấy mẫu phân mới thải hoặc lấy trực tiếp từ trực tràng con vật. Để riêng mỗi mẫu phân vào một túi nilon nhỏ, mỗi túi đều có nhãn ghi: loại gia súc (bê, nghé), địa điểm, tuổi, trạng thái phân, thời gian lấy mẫu và các biểu hiện lâm sàng của bê, nghé (những thông tin này cũng đƣợc ghi vào nhật ký đề tài). Trong quá trình lấy mẫu, căn cứ vào yếu tố cần xác định có liên quan đến đặc điểm dịch tễ để lấy mẫu cho tƣơng đối đồng đều về các yếu tố khác.
Các mẫu đƣợc xét nghiệm bằng phƣơng pháp Darling ngay trong ngày (hoặc bảo quản ở nhiệt độ 2 - 4oC và xét nghiệm trong thời gian không quá 3 ngày).
+ Thu nhận Oocyst từ mẫu phân bê, nghé nhiễm nặng bằng phƣơng pháp Darling, vớt Oocyst đƣa vào nƣớc sạch rồi ly tâm lấy cặn.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
2.4.1.2. Phương pháp định loài cầu trùng ký sinh ở bê, nghé ở tỉnh Thái Nguyên
Định loài cầu trùng theo khoá định loài của Ajayi J. A. (2004) [51] và Levine N. (Ed) (1985) [63], dựa trên 2 căn cứ:
- Kích thƣớc (đo bằng trắc vi thị kính), hình thái, màu sắc, lỗ noãn, cấu tạo vỏ Oocyst (quan sát trên kính hiển vi ở độ phóng đại 400 lần).
- Thời gian Oocyst sản sinh bào tử
Nuôi cấy Oocyst cầu trùng bê, nghé: Đƣa Oocyst cầu trùng đã thu nhận đƣợc vào dung dịch Bicromate kali 2,5%, lắc nhẹ thƣờng xuyên để phát triển thành Oocyst có sức gây bệnh. Hàng ngày dùng công tơ hút ( = 2 – 3 mm) lấy dung dịch Bichromat kali 2,5% có chứa Oocyst, soi kính, ghi lại sự biến đổi hình thái và cấu trúc của Oocyst. Từ đó, xác định đƣợc thời gian phát triển của Oocyst thành Oocyst gây bệnh trong môi trƣờng
Bichromat kali 2,5%.
Dùng trắc vi thị kính đo kích thƣớc của Oocyst cầu trùng dƣới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần, ghi lại hình ảnh Oocyst dƣới kính hiển vi.
2.4.1.3. Những yếu tố cần xác định có liên quan đến tình hình nhiễm cầu trùng bê nghé trùng bê nghé
Quy định các lứa tuổi bê, nghé
Tuổi bê, nghé đƣợc xác định bằng cách xem răng và hỏi chủ gia súc. Phân tuổi bê, nghé thành 4 lứa tuổi:
2 tháng tuổi. 2 - 4 tháng tuổi. 4 - 8 tháng tuổi. > 8 - 12 tháng tuổi.
* Phương pháp bố trí theo dõi
Chúng tôi theo dõi bê, nghé ở 4 lứa tuổi và lặp lại 3 lần tại 3 huyện Phú Lƣơng, Phú Bình, Phổ Yên của tỉnh Thái Nguyên. Bê, nghé các lứa tuổi
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
tƣơng đối đồng đều về tính biệt, điều kiện chăm sóc nuôi dƣỡng, trong cùng một mùa vụ và đƣợc bố trí theo sơ đồ sau:
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Tuổi bê, nghé (tháng) Địa phƣơng (huyện) Phú Lƣơng Phú Bình Phổ Yên 2 18 18 15 2 - 4 28 34 26 > 4 - 8 28 33 31 8 - 12 46 44 47 Tính chung 120 129 119
* Phương pháp xác định tỷ lệ nhiễm cầu trùng theo tuổi bê, nghé
Xét nghiệm phân theo phƣơng pháp đã trình bày ở mục 2.4.1.1
2.4.1.4. Phương pháp theo dõi và xác định tỷ lệ nhiễm cầu trùng theo mùa vụ * Mùa vụ trong năm được theo dõi gồm:
+ Vụ Hè - Thu : từ tháng 4 đến tháng 9
+Vụ Đông - Xuân : từ tháng 10 đến tháng 3 năm sau.
* Phương pháp bố trí lấy mẫu
Mẫu đƣợc thu thập theo sơ đồ sau:
Mùa vụ Số bê, nghé ở Phú Lƣơng (con) Số bê, nghé ở Phú Bình (con) Số bê, nghé ở Phổ Yên (con) Đông - Xuân 54 59 52 Hè – Thu 66 70 67 Tính chung 120 129 119
* Phương pháp xác định tỷ lệ nhiễm cầu trùng theo mùa vụ
Tiến hành theo phƣơng pháp đã trình bày ở mục 2.4.1.1
2.4.1.5. Bố trí xác định vai trò của cầu trùng trong hội chứng tiêu chảy ở bê, nghé tỉnh Thái Nguyên bê, nghé tỉnh Thái Nguyên
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Thu thập mẫu phân bê, nghé khỏe và bê, nghé tiêu chảy tƣơng đƣơng nhau về lứa tuổi, cùng mùa vụ, ở các địa phƣơng có địa hình tƣơng tự nhau.
* Phương pháp xác định: Xét nghiệm phân bằng phƣơng pháp Darling để xác định tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm cầu trùng bê, nghé. Từ đó đánh giá vai trò của cầu trùng trong hội chứng tiêu chảy của bê, nghé dựa vào sự khác nhau về tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm cầu trùng giữa bê, nghé khỏe và bê, nghé tiêu chảy.
2.4.1.6. Phương pháp xác định bê nghé nhiễm cầu trùng và cường độ nhiễm
- Phƣơng pháp xác định bê, nghé nhiễm cầu trùng: Tất cả các mẫu phân bê, nghé đều đƣợc xét nghiệm bằng phƣơng pháp Darling với dung dịch muối NaCl bão hòa, tìm Oocyst dƣới kính hiển vi quang học (x 100 và x 400). Mẫu phân của bê nghé phát hiện thấy Oocyst cầu trùng đƣợc đánh giá là bê nghé nhiễm cầu trùng.
- Phƣơng pháp xác định cƣờng độ nhiễm cầu trùng: Cƣờng độ nhiễm cầu trùng đƣợc xác định bằng số lƣợng Oocyst/g phân (đếm trên buồng đếm Mc.Master) nhƣ mô tả của Nguyễn Thị Kim Lan và cs (2008) [16].
- Phƣơng pháp làm: Cân 4 gam phân vào cốc thủy tinh, thêm 56 ml dung dịch nƣớc muối bão hòa, khuấy đều cho tan phân. Lọc qua lƣới thép vào 1 cốc khác và khuấy đều. Trong khi khuấy, lấy công tơ hút hút lấy dung dịch phân nhỏ đầy cả hai buồng đếm Mc. Master (mỗi buồng đếm có dung tích 0,5 ml). Để yên 5 phút rồi kiểm tra dƣới kính hiển vi (x100).
Đếm toàn bộ số Oocyst trong những ô của hai buồng đếm, rồi tính theo công thức:
Số Oocyst/gam phân =
Tổng số Oocyst ở 2 buồng đếm x 60 4
(tổng số Oocyst ở 2 buồng đếm là số Oocyst có trong 1 ml dung dịch phân). Căn cứ vào số Oocyst/gam phân và biểu hiện lâm sàng của bê, nghé, quy định mức cƣờng độ nhiễm nhƣ sau:
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
+ ≤ 500 Oocyst/g phân: cƣờng độ nhiễm nhẹ (+).
+ 500 - 1000 Oocyst/g phân: cƣờng độ nhiễm trung bình (++). + 1000 - 5000 Oocyst/g phân: cƣờng độ nhiễm nặng (+++). + 5000 Oocyst/g phân: cƣờng độ nhiễm rất nặng (++++).
2.4.2. Bố trí theo dõi sự ô nhiễm Oocyst cầu trùng bê, nghé ở chuồng nuôi, khu vực xung quanh chuồng nuôi bê, nghé khu vực xung quanh chuồng nuôi bê, nghé
* Phương pháp bố trí theo dõi
Lấy mẫu theo sơ đồ sau:
Địa phƣơng (huyện, xã) Mẫu nền chuồng Mẫu đất xung quanh chuồng Phú Lƣơng 31 26 Phấn Mễ 13 9 Tức Tranh 7 7 Cổ Lũng 11 10 Phú Bình 37 25 Lƣơng Phú 10 9 Đào Xá 14 8 Tân Kim 13 8 Phổ Yên 32 24 Hồng Tiến 11 8 Đồng Tiến 9 9 Tiên Phong 12 7 Tính chung 98 75
Phương pháp thu thập mẫu
- Mẫu đất hoặc cặn nền chuồng nuôi bê, nghé: tại mỗi ô chuồng, lấy mẫu đất (cặn) ở 4 góc chuồng, trộn đều đƣợc một mẫu xét nghiệm (khoảng 100 gam/mẫu). Mỗi mẫu đƣợc để riêng trong túi nilon có nhãn ghi: loại mẫu, địa điểm và thời gian lấy mẫu.
- Mẫu đất bề mặt khu vực xung quanh chuồng: lấy mẫu đất bề mặt tƣơng tự nhƣ cách lấy mẫu nền chuồng.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
* Phương pháp xét nghiệm mẫu: Xét nghiệm các loại mẫu trên bằng phƣơng pháp Darling để phát hiện Oocyst cầu trùng.
2.4.3. Nghiên cứu sức đề kháng của Oocyst cầu trùng bê, nghé
2.4.3.1. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các mức nhiệt độ đến khả năng sống của Oocyst cầu trùng
* Ảnh hưởng của các mức nhiệt độ đến khả năng sống của Oocysst cầu trùng bê nghé mới theo phân ra ngoại cảnh
- Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí 4 lần ở 4 mức nhiệt độ khác nhau: 350C, 400C, 450C, 500C. Mỗi lần thí nghiệm đƣợc bố trí ở 10 đĩa petri có đƣờng kính 30 cm có chứa 1.000 – 5.000 Oocyst.
- Phƣơng pháp theo dõi và xác định sự tồn tại của Oocyst mới theo phân ra ngoại cảnh ở các mức nhiệt độ khác nhau:
Thu nhận Oocyst cầu trùng từ các mẫu phân bê nghé mới thải cho vào các đĩa petri sạch. Đƣa đĩa petri lên kính hiển vi quan sát và đếm số Oocyst. Điều chỉnh mức nhiệt độ tủ ấm trong từng lần thí nghiệm và đặt các đĩa petri có chứa Oocyst cầu trùng vào tủ ấm. Cứ sau 1 giờ lấy đĩa ra kiểm tra để theo dõi sự thay đổi về hình thái, lớp vỏ, nguyên sinh chất của Oocyst cầu trùng trên kính hiển vi. Đếm tổng số Oocyst/3 vi trƣờng và số Oocyst chết. Từ đó xác định đƣợc tỷ lệ và thời gian Oocyst chết.
* Ảnh hưởng của các mức nhiệt độ đến khả năng sống của Oocyst cầu trùng bê nghé có sức gây bệnh
- Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí 4 lần ở 4 mức nhiệt độ khác nhau: 350C, 400C, 450C, 500C. Mỗi lần thí nghiệm đƣợc bố trí ở 10 đĩa petri có đƣờng kính 30 cm có chứa 1.000 – 5.000 Oocyst.
- Phƣơng pháp theo dõi và xác định sự tồn tại của Oocyst có sức gây bệnh ở các mức nhiệt độ khác nhau:
Thu nhận Oocyst cầu trùng đã phát triển thành Oocyst có sức gây bệnh từ dung dịch nuôi cấy Bichromate kali 2,5% vào các đĩa petri sạch. Đƣa đĩa
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
petri lên kính hiển vi quan sát và đếm số Oocyst. Điều chỉnh mức nhiệt độ tủ ấm trong từng lần thí nghiệm và đặt các đĩa petri có chứa Oocyst cầu trùng vào tủ ấm. Cứ sau 1 giờ lấy đĩa ra kiểm tra để theo dõi hình thái, màu sắc, sự biến đổi của Oocyst cầu trùng trên kính hiển vi. Đếm tổng số Oocyst/3 vi trƣờng và số Oocyst chết. Từ đó xác định đƣợc tỷ lệ và thời gian Oocyst chết.
2.4.3.2. Ảnh hưởng của chất sát trùng đến khả năng sống của Oocyst cầu trùng
* Ảnh hưởng của chất sát trùng đến khả năng phát triển của Oocyst cầu trùng bê nghé mới theo phân ra ngoại cảnh
- Bố trí thí nghiệm: chia 3 lô thí nghiệm:
+ Lô 1: 10 đĩa petri có chứa Oocyst mới theo phân ra ngoại cảnh đƣợc thu thập từ các mẫu phân bê nghé; mỗi đĩa có chứa 1.000 – 5.000 Oocyst. Sử dụng thuốc sát trùng Povidine 10% phun trực tiếp lên mặt đĩa petri.
+ Lô 2: bố trí nhƣ lô 1, chỉ khác là sử dụng thuốc sát trùng Han – Iodine 10%.
+ Lô 3: bố trí nhƣ lô 1, chỉ khác là sử dụng thuốc sát trùng Benkocid 5%.
Thí nghiệm đƣợc lặp lại 2 lần.
- Phƣơng pháp kiểm tra và xác định sự phát triển của Oocyst cầu trùng Cứ 1 giờ lại đƣa đĩa petri đã đƣợc phun thuốc sát trùng lên kính hiển vi quan sát và theo dõi hình thái, màu sắc và sự biến đổi của Oocyst cầu trùng. Đếm tổng số Oocyst/3 vi trƣờng và số Oocyst chết. Từ đó xác định đƣợc tỷ lệ và thời gian Oocyst chết.
* Ảnh hưởng của chất sát trùng đến khả năng phát triển của Oocysst cầu trùng bê nghé có sức gây bệnh
- Bố trí thí nghiệm: chia 3 lô thí nghiệm:
+ Lô 1: 10 đĩa petri có chứa Oocyst có sức gây bệnh đƣợc thu nhận từ dung dịch Bichromate kali 2,5%; mỗi đĩa có chứa 1.000 – 5.000 Oocyst. Sử dụng thuốc sát trùng Povidine 10% phun trực tiếp lên mặt đĩa petri.
+ Lô 2: bố trí nhƣ lô 1, chỉ khác là sử dụng thuốc sát trùng Han – Iodine 10%.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
+ Lô 3: bố trí nhƣ lô 1, chỉ khác là sử dụng thuốc sát trùng Benkocid 5%.
Thí nghiệm đƣợc lặp lại 2 lần.
- Phƣơng pháp kiểm tra và xác định sự phát triển của Oocyst cầu trùng Cứ 1 giờ lại đƣa đĩa petri đã đƣợc phun thuốc sát trùng lên kính hiển vi quan sát và theo dõi hình thái, màu sắc và sự biến đổi của Oocyst cầu trùng. Đếm tổng số Oocyst/3 vi trƣờng và số Oocyst chết. Từ đó xác định đƣợc tỷ lệ và thời gian Oocyst chết.
2.4.4. Phƣơng pháp nghiên cứu đặc điểm bệnh lý, lâm sàng của bệnh cầutrùng bê, nghé cầutrùng bê, nghé
2.4.4.1. Phương pháp theo dõi biểu hiện lâm sàng chủ yếu của bê, nghé bị bệnh cầu trùng
* Phương pháp bố trí
Trong quá trình xét nghiệm phân, đã phát hiện đƣợc những bê, nghé nhiễm cầu trùng. Chọn những bê, nghé chỉ nhiễm cầu trùng, không nhiễm bất cứ loại giun sán và bệnh truyền nhiễm nào khác, theo dõi các biểu hiện lâm sàng của những bê, nghé này.
* Phương pháp theo dõi
Sử dụng các phƣơng pháp chẩn đoán lâm sàng nhƣ: đo thân nhiệt bằng nhiệt kế 430C, quan sát thể trạng, lông, da; quan sát màu sắc các niêm mạc; theo dõi màu sắc, trạng thái và mùi phân, số lần đi ỉa trong ngày; tình trạng ăn uống....
2.4.4.2. Phương pháp xét nghiệm máu của nghé bị bệnh cầu trùng và nghé khỏe * Bố trí xét nghiệm máu nghé
Tiến hành hai đợt xét nghiệm máu của hai nhóm nghé. Một nhóm gồm những nghé nhiễm cầu trùng với mức độ nặng. Nhóm kia là nghé khoẻ.
Lấy mẫu máu của nghé khỏe và nghé bị bệnh cầu trùng ở tĩnh mạch cổ (1ml/con) cho vào ống nghiệm có tráng chất chống đông máu. Bố trí thí nghiệm theo sơ đồ sau:
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Nghé nhiễm cầu trùng Nghé khỏe
Số con Số mẫu máu Số con Số mẫu máu
3 nghé 6 3 nghé 6
* Phương pháp xác định
Xác định số lƣợng hồng cầu, số lƣợng bạch cầu, hàm lƣợng huyết sắc tố bằng máy ABX Micros tại khoa huyết học - Bệnh viện Đa khoa Trung ƣơng.
Công thức bạch cầu đƣợc xác định bằng phƣơng pháp Tristova: làm tiêu bản máu, nhuộm Giemsa, đếm số lƣợng từng loại bạch cầu và tính tỷ lệ phần trăm từng loại.
2.4.5. Nghiên cứu biện pháp phòng, trị cầu trùng cho bê, nghé
2.4.5.1. Bố trí thí nghiệm xác định công thức ủ phân có khả năng sinh nhiệt tốt để diệt Oocyst cầu trùng nhiệt tốt để diệt Oocyst cầu trùng
Chúng tôi đã thực hiện thí nghiệm với 3 công thức ủ, nhằm lựa chọn đƣợc một công thức có khả năng sinh nhiệt tốt nhất.
* Phương pháp bố trí thí nghiệm
- Chuẩn bị nguyên liệu ủ, bố trí ủ theo 3 công thức sau:
Công thức 1: Các nguyên liệu ủ đƣợc chuẩn bị theo tỷ lệ: + Phân chuồng: 800 - 1000 kg.
+ Lá xanh băm nhỏ: 200 kg. + Tro bếp: 60 kg.
Công thức 2: Các nguyên liệu ủ đƣợc bố trí theo tỷ lệ: + Phân chuồng: 800 - 1000 kg.
+ Lá xanh băm nhỏ: 200 kg. + Vôi bột: 20 kg.
Công thức 3: Các nguyên liệu ủ đƣợc bố trí theo tỷ lệ: + Phân chuồng: 800 - 1000 kg.
+ Lá xanh băm nhỏ: 200 kg. + Tro bếp: 60 kg.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
(Theo tài liệu của Trịnh Văn Thịnh và cs (1982) [39], Phạm Văn Khuê và cs (1996) [11], Nguyễn Thị Kim Lan (2012) [17]).
- Cách ủ phân: Trộn đều các nguyên liệu theo tỷ lệ của mỗi công thức ủ, cho vào mỗi bao nilon 20 kg hỗn hợp nguyên liệu đã trộn của mỗi công thức trên.
Cũng trộn đều 5 kg phân của bê, nghé nhiễm cầu trùng nặng với các nguyên liệu khác (lá xanh băm nhỏ, tro bếp, vôi bột) theo tỷ lệ nhƣ 3 công thức, sau đó chia vào các túi vải nhỏ (mỗi túi 10 - 15 g), đặt vào trong các bao phân ủ (ở các vị trí khác nhau). Buộc miệng bao để tạo môi trƣờng yếm khí trong bao.
* Phương pháp theo dõi khả năng sinh nhiệt và tác dụng diệt Oocyst của 3 công thức ủ
Hàng ngày theo dõi nhiệt độ phân ủ, đồng thời lấy từ mỗi bao 1 túi vải để xét nghiệm Oocyst cầu trùng. Từ đó xác định đƣợc khả năng sinh nhiệt của