2.1.2.1. Hóa chất
a. Hóa chất và dịch chiết dùng trong nuôi cấy vi sinh vật
- Amonium sulphate (NH4)2SO4; Calcium Cloride CaCl2; Magnesium sulphate MgSO4.7H2O; Mangansium sulphate MnSO4.H2O; Potassium dihydrophosphate KH2PO4; Ure
- Glucose; dịch chiết khoai tây; dịch chiết nấm men; dịch chiết lúa mạch; pepton; trypton và agar.
b. Hóa chất, chất chuẩn, thuốc thử và cơ chất dùng trong phân tích
* Chất chuẩn: Glucose (Trung Quốc); Xylose (Merk); Enzym Cellulase và Xylanase (hãng Amano và Fluka).
* Hóa chất sử dụng để pha dung dịch đệm: Acid acetic CH3COOH; Natri acetate CH3COONa; Tween 20, CaCl2.
* Cơ chất: Xylan và CMC.
* Thuốc thử: 2-Hydroxy-3,5-dinitrobenzoic acid (Merk); Potassium sodium tartate tetrahydrate; Sodium hydroxit NaOH; KOH.
2.1.2.2. Môi trường hoạt hóa và nuôi cấy vi sinh vật
a. Thành phần môi trường PGA (g/l) hoạt hóa, nuôi cấy Trichoderma reesei VTT-D-80133
- Khoai tây : 200 g
- Glucose : 20 g
- Agar : 20 g
Thêm nước cất đủ 1000ml, pH 6,5 ± 0,1
b. Thành phần môi trường Hansen (g/l) hoạt hóa, nuôi cấy Saccharomyces cerevisae - Glucose : 50 g - Trypton : 10 g - KH2PO4 : 2 g - MgSO4.7H2O : 2 g Thêm nước cất đủ 1000 ml, pH 5,5 ± 0,1
c. Thành phần môi trường YDP (g/l) hoạt hóa và nuôi cấy nấm men Pichia stipitis - Glucose : 20 g - Yeast extract : 1,5 g - Peptone : 5 g - Malt extract : 2 g Thêm nước cất đủ 1000 ml, pH 5,0 ± 0,1
d. Thành phần môi trường Mandle (g/l) sử dụng trong thủy phân rơm - Urê : 0,3 g - (NH4)2SO4 : 0,3 g - KH2PO4 :1,4 g - CaCl2 : 2 g - MgSO4.7H2O : 0,3 g - Peptone : 0,75 g - Dịch chiết nấm men : 0,25 g
Thêm các yếu tố vi lượng, sử dụng 1% (v/v) muối hòa tan:
- FeSO4.7H2O : 0,5 g
- MnSO4 : 0,16 g
- ZnSO4 : 0,14 g
- CoCl2 : 2 g
pH trước khử trùng : 5,5 – 6,0
e. Thành phần môi trường (g/l) lên men ethanol
- Dịch chiết nấm men : 0,01 g
- Pepton : 0,25 g
2.2 Các phương pháp sử dụng
2.2.1 Phương pháp quan sát hình thái Trichoderma reesei
2.2.1.1. Quan sát đại thể
Dùng que cấy móc đã hơ qua ngọn lửa đèn cồn để vô trùng lấy bào tử của nấm chuyển sang môi trường thạch nghiêng PDA. Ủ ở nhiệt độ phòng trong thời gian 3 - 7 ngày. Quan sát hình dạng và màu sắc khuẩn lạc của nấm sợi ở mặt trên và mặt dưới
2.2.1.2. Quan sát vi thể
Dùng que cấy móc lấy sợi tơ nấm đặt lên miếng lame, sau đó dùng lamelle đè nhẹ lên tơ nấm. Quan sát dưới kính hiển vi vật kính x 100 cuống sinh bào tử đính và vách ngăn tế bào
2.2.2 Phương pháp quan sát hình thái tế bào nấm men Pichia stipitis và Saccharomyces cerevisae
Tế bào nấm men sau khi được hoạt hóa trong môi trường lỏng và tiến hành cấy lên môi trường thạch nghiêng. Sau thời gian 3 ngày, tiến hành soi tế bào không nhuộm và nhuộm bằng dung dịch fuchshin, soi dưới kính hiển vi ở vật kính x 40, x 100.
2.2.3 Phương pháp xác định mật độ bào tử nấm sợi và tế bào nấm men bằng buồng đếm hồng cầu
Buồng đếm hồng cầu thường là một phiến kính dày 2 - 3mm có một vùng đĩa đếm nằm giữa phiến kính và được bao quanh bởi một rãnh. Đĩa đếm thấp hơn bề mặt của phiến kính khoảng 1/10mm. Vùng đĩa đếm có diện tích 1 mm và được chia 25 ô vuông lớn có diện tích mỗi ô là 1/25 mm2 và 400 ô vuông nhỏ hơn, mỗi ô nhỏ có diện tích là 1/400 mm2 và chiều cao là 1/10. Như vậy, thể tích của mỗi ô nhỏ là 1/400mm2 x 0.1 mm = 1/4000mm3 hay 1/4000000 ml
Phương pháp đếm: Lắc đều mẫu pha loãng, đặt phiến lam kính lên trên vùng đếm. Dùng ống hút vô trùng lấy mẫu, cho một giọt vào mép lam kính, do lực mao dẫn, dịch mẫu dàn vào mặt trên vùng đếm. Chú ý không để thành bọt khí trong vùng đếm hoặc tràn dịch mẫu xuống rãnh. Đặt buồng đếm lên bàn kính hiển vi và để yên trong 3 - 5 phút, sau đó đếm bào tử trong 5 ô lớn chéo nhau, chỉ đếm các bào tử nằm trong lòng ô con và những bào tử nằm trên hai cạnh liên tiếp cùng chiều. Đếm lần lượt từ ô con 1 đến ô con 16. Pha loãng mẫu: chuẩn bị một loạt ống nghiệm (số 1 – 4) chứa 9ml dung dịch sinh lý chứa Tween 80, 0,1% vô trùng và một số ống hút 1 ml vô trùng
Hút 1 ml dịch huyền phù bào tử nấm mốc đã chuẩn bị cho vào ống nghiệm số 1, lắc đều trên máy vortex, ta được độ pha loãng 10-1 và tiếp tục như vậy ta hút 1ml từ ống số 1 cho vào ống số 2, từ ống số 2 sang ống số 3, ...ta sẽ được các độ pha loãng tương ứng, 10-2 , 10-3,...
Tính số lượng bào tử theo công thức A x 4000 x 103 x n N =
b
N: Số lượng bào tử trong 1 ml dịch huyền phù a: Số lượng bào tử trong 5 ô lớn (80 ô con) b: Số ô con trong 5 ô lớn (16 ô x 5 = 80 ô con) 103: Số chuyển mm3 thành ml (1000mm3 = 1ml) n: Độ pha loãng của mẫu
Chú ý: Nồng độ dịch huyền phù pha loãng sao cho mật độ trong mỗi ô nhỏ không quá 10 bào tử. Số bào tử đếm được trong 5 ô lớn phải lớn hơn 200 mới đảm bảo được mức chính xác của phương pháp
2.2.4. Phương pháp định lượng đường khử 2.2.4.1. Nguyên tắc
Lượng đường khử sinh ra phản ứng với 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic acid (DNS) cho dung dịch có màu vàng - cam. Dung dịch màu này được xác định bằng phương pháp so màu trên máy quang phổ ở bước sóng 540 nm.
2.2.4.2. Xây dựng đường chuẩn
Xây dựng đường chuẩn glucose với nồng độ từ 50 – 300 µg/ml. Các bước dựng đường chuẩn glucose được tóm tắt qua bảng 2.1
Bảng 2.1: Tóm tắt quá trình dựng đường chuẩn glucose
Ống nghiệm số 0 1 2 3 4 5
Nồng độ glucose chuẩn (µg/ml) 0 50 100 150 200 300
Dung dịch glucose chuẩn (1mg/ml) (ml) 0 0,5 1,0 1,5 2,0 3,0
DD đệm acetate 0,1 M, pH 5 (ml) 10 9,5 9,0 8,5 8,0 7,0
Ống nghiệm số 0' 1' 2' 3' 4' 5'
Hút dung dịch glucose chuẩn (µl) 60 60 60 60 60 60
Dung dịch DNS (µl) 300 300 300 300 300 300
Lắc đều, đun cách thủy 10 phút và làm lạnh dưới vòi nước
Nước cất (ml) 3 3 3 3 3 3
Lắc đều, So màu trên máy quang phổ Hewlett-Packard 8453 với chương trình HPUV-vis Chemstations ở bước sóng 540 nm
2.2.4.3. Phương pháp đo mẫu thí nghiệm
Dung dịch thí nghiệm là dịch thủy phân sau khi lọc và thu dịch lọc từ quá trình thủy phân rơm bằng nấm mốc Trichoderma reesei
Bảng 2.2: Các bước tiến hành đo mẫu thí nghiệm
Bước thực hiện Mẫu thử
1. Dung dịch thí nghiệm (µl) 60
2. Dung dịch DNS (µl) 300
3. Trộn đều Trộn đều
4. Đun cách thủy (phút) 10
5. Làm nguội dưới vòi nước -
6. Nước cất thêm vào (ml) 3
7. Trộn đều Trộn đều
So màu trên máy quang phổ Hewlett-Packard 8453 với chương trình HPUV-vis Chemstations ở bước sóng 540 nm 2.2.4.4. Tính kết quả Từ đồ thị đường chuẩn y = 0,0003 X – 0,0064, Suy ra: X = (y + 0,0064)/0,0003 X: là nồng độ glucose (µg/ml) y : mật độ quang
2.2.5. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme cellulase và enzyme xylanase2.2.5.1. Nguyên tắc: Phương pháp này dựa vào sự thủy phân cơ chất 2.2.5.1. Nguyên tắc: Phương pháp này dựa vào sự thủy phân cơ chất carboxymethyl cellulose (CMC) bởi enzyme carboxymethyl cellulase (CMCase) và cơ chất xylan bởi enzyme xylanase ở pH 4,5 và nhiệt độ 40oC. Đơn vị hoạt tính enzyme cellulase/xylanase (IU/ml) là lượng enzyme mà sẽ giải phóng lượng đường khử (như glucose/xylose) khi thủy phân CMC/xylan với vận tốc 1 µmol /phút dưới các điều kiện phản ứng.
2.2.5.2. Xây dựng đường chuẩn Glucose/Xylose xác định hoạt tính enzyme
Xây dựng đường chuẩn glucose/xylose với nồng độ từ 50 – 300 µg/ml. Các bước dựng đường chuẩn để xác định hoạt tính enzyme được tóm tắt qua bảng 2.3
Bảng 2.3: Tóm tắt quá trình dựng đường chuẩn glucose/xylose Ống số 0 1 2 3 4 5 Nồng độ glucose/xylose (µg/ml) 0 50 100 150 200 300 Dung dịch glucose/xylose (1mg/ml) (µl) 0 60 60 60 60 60 DD đệm acetate 0,1 M, pH 5 (µl) 60 0 0 0 0 0 Dung dịch CMC 2%/xylan1% (µl) 600 600 600 600 600 600 Dung dịch DNS (µl) 300 300 300 300 300 300 Nước cất (ml) 3 3 3 3 3 3
2.2.5.3. Phương pháp đo mẫu thí nghiệm
Thí nghiệm tiến hành mỗi mẫu với 5 ống nghiệm: 3 ống cho phản ứng (Am), 1 ống đối chứng (A0), 1 ống blank. Các bước thực hiện như bảng 2.4.
Bảng 2.4: Các bước của quá trình xác định hoạt tính cellulase và xylanase
Bước thực hiện Mẫu Am Mẫu A0
1. Đệm acetate 0,1M, pH=4,5 (µl) 0 0
2. Dịch enzym (µl) 60 60
3. Ủ 40oC (phút) 5 0
4. Cơ chất (CMC/xylan) (µl) 600 300 (bước 7)
5. Trộn đều Trộn đều Trộn đều
6. Ủ 40oC (phút) 20 0
7. DNS (µl) 300 600 (bước 4)
8. Trộn đều Trộn đều Trộn đều
9. Đun cách thủy 10 phút 10 10
10. Làm nguội Làm nguội Làm nguội
11. Nước cất (ml) 3 3
12. Trộn đều Trộn đều Trộn đều
So màu trên máy quang phổ Hewlett-Packard 8453 với chương trình HPUV-vis Chemstations ở bước sóng 540 nm
2.2.5.4. Xác định hoạt tính enzyme cellulase và xylanase
Đơn vị hoạt tính enzyme cellulase/xylanase (IU/ml) là lượng enzyme mà sẽ giải phóng lượng đường khử (như glucose/xylose) khi thủy phân CMC/xylan với vận tốc 1 µmol /phút dưới các điều kiện phản ứng
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố thời gian đến hàm lượng đường khử trong quá trình thủy phân rơm trong quá trình thủy phân rơm
* Mục tiêu: Xác định thời điểm hàm lượng đường khử được tạo ra nhiều nhất ở các mốc thời gian bố trí thí nghiệm.
* Bố trí thí nghiệm
- Sử dụng 1 gam rơm đã chuẩn bị cho vào 100 ml môi trường Mandle chứa trong bình tam giác 250 ml, xác định pH trước khi hấp khử trùng của các mẫu thí nghiệm, đậy lại bằng nút bông, hấp khử trùng ở 1210C, trong thời gian 15 phút.
- Bào tử nấm mốc từ ống nghiệm được chuyển vào lọ thủy tinh có chứa nước cất đã hấp khử trùng, xác định mật độ bào tử sao cho dịch bào tử là 107
bào tử/ml. Bổ sung dịch bào tử mốc vào hỗn hợp rơm sau khi hấp khử trùng để nguội theo tỉ lệ 10% (v/v). Lắc trên máy lắc ở điều kiện nhiệt độ phòng và theo dõi hàm lượng đường khử theo mỗi mốc thời gian 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 9 ngày, 11 ngày và 13 ngày. Mẫu được lập lại 3 lần.
* Chỉ tiêu theo dõi
- Hàm lượng đường khử (mg/g)
- Hoạt tính enzyme cellulase, xylanase (IU/ml) - Hiệu suất thủy phân (%)
2.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của mật độ bào tử mốc đến hàm lượng đường khử trong quá trình thủy phân rơm khử trong quá trình thủy phân rơm
* Mục tiêu: Xác định mật độ bào tử mốc thích hợp bổ sung vào môi trường thủy phân để thu được hàm lượng đường khử nhiều nhất ở các mật độ bào tử bố trí thí nghiệm.
Chuẩn bị hỗn hợp rơm và điều kiện thí nghiệm tương tự thí nghiệm 2.3.1. Bào tử nấm mốc từ ống nghiệm được chuyển vào lọ thủy tinh có chứa nước cất đã hấp khử trùng, xác định mật độ bào tử sao cho dịch bào tử lần lượt là 106, 107, 108 bào tử/ml. Dựa vào kết quả của thí nghiệm 2.3.1 về thời gian tối ưu, tiếp tục bố trí thí nghiệm bổ sung với 3 kiểu mật độ bào tử mốc là 106, 107, 108 bào tử/ml. Mẫu được lập lại 3 lần.
* Chỉ tiêu theo dõi
- Hàm lượng đường khử (mg/g)
- Hoạt tính enzyme cellulase, xylanase (IU/ml). - Hiệu suất thủy phân (%)
2.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố pH ban đầu đến hàm lượng đường khử trong quá trình thủy phân rơm khử trong quá trình thủy phân rơm
* Mục tiêu: Theo dõi sự thay đổi pH trong quá trình thủy phân rơm và hàm lượng đường khử được tạo ra để xác định pH tối ưu được bố trí trong thí nghiệm
* Bố trí thí nghiệm
Chuẩn bị hỗn hợp rơm và điều kiện thí nghiệm tương tự thí nghiệm 2.3.1. Mật độ bào tử nấm mốc là kết quả của thí nghiệm 2.3.2. Thí nghiệm được lập lại 3 lần, với pH ban đầu của hỗn hợp rơm được điều chỉnh là 4,0; 4,5; 5,0; 5,5.
* Chỉ tiêu theo dõi
Theo mỗi mốc thời gian: 5 ngày lấy dịch thủy phân xác định các chỉ tiêu - Hàm lượng đường khử (mg/g)
- Hoạt tính enzyme cellulase, xylanase (IU/ml) - Hiệu suất thủy phân (%)
2.3.4. Khảo sát hàm lượng đường khử tạo ra khi không sử dụng và sử dụng dung dịch đệm Na-acetate trong quá trình thủy phân rơm
* Mục tiêu: Theo dõi hàm lượng đường khử được tạo ra trong quá trình thủy phân rơm để so sánh sự khác biệt giữa sự duy trì pH = 4,5 bằng dung dịch đệm Na-acetate 0,1 M, pH = 4,5 và điều chỉnh pH ban đầu là 4,5.
* Bố trí thí nghiệm
Chuẩn bị hỗn hợp rơm và điều kiện thí nghiệm tương tự thí nghiệm 2.3.1. Mật độ bào tử nấm mốc là kết quả của thí nghiệm 2.3.2. Thí nghiệm được lập lại 3 lần, với pH ban đầu của hỗn hợp rơm được điều chỉnh bằng dung dịch đệm Na-acetate 0,1 M, pH = 4,5 và điều chỉnh pH ban đầu là 4,5. Thí nghiệm được lập lại 3 lần.
* Chỉ tiêu theo dõi
- Hàm lượng đường khử (mg/g)
- Hoạt tính enzyme cellulase, xylanase (IU/ml). - Hiệu suất thủy phân (%)
2.3.5. Khảo sát ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt lên quá trình thủy phân rơm phân rơm
* Mục tiêu: Khảo sát ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt đến hàm lượng đường khử được tạo ra trong quá trình thủy phân rơm
* Bố trí thí nghiệm
Chuẩn bị hỗn hợp rơm và điều kiện thí nghiệm tương tự thí nghiệm 2.3.1. Bào tử nấm mốc từ ống nghiệm được chuyển vào lọ thủy tinh có chứa Tween-80, 0,1% và nước cất đã hấp khử trùng, mật độ bào tử bổ sung là kết quả của thí nghiệm 2.3.2. Thí nghiệm được lập lại 3 lần.
* Chỉ tiêu theo dõi
- Hàm lượng đường khử (mg/g)
- Hoạt tính enzyme cellulase, xylanase (IU/ml) - Hiệu suất thủy phân (%)
2.3.6. Thủy phân rơm trong bình lên men với các điều kiện thời gian, mật độ BTM, pH và chất hoạt động bề mặt đã chọn ở các thí nghiệm
* Mục tiêu: Khảo sát hàm lượng đường khử được tạo ra trong quá trình thủy phân rơm
* Bố trí thí nghiệm
- Dùng 5 gam rơm đã chuẩn bị cho vào 500 ml môi trường Mandle chứa trong bình lên men, duy trì pH ở mức 4,5 bằng dung dịch đệm Natri-acetate 0,1
M, pH 4,5.
- Bào tử nấm mốc từ ống nghiệm được chuyển vào lọ thủy tinh có chứa Tween-80, 0,1% đã hấp khử trùng, mật độ bào tử bổ sung là 107 tế bào/ml với tỉ lệ 10% (v/v).
- Đặt bình lên men trên máy khuấy từ ở điều kiện nhiệt độ phòng. Theo dõi hàm lượng đường khử trong thời gian 5 ngày. Thí nghiệm được lập lại 3 lần
* Chỉ tiêu theo dõi
- Hàm lượng đường khử (mg/g)
- Hoạt tính enzyme cellulase, xylanase (IU/ml) - Hiệu suất thủy phân (%)
2.3.7. Lên men ethanol trong điều kiện cung cấp oxi với hai mức độ khác nhau với chủng Saccharomyces cerevisiae và Pichia stipitis nhau với chủng Saccharomyces cerevisiae và Pichia stipitis
* Mục tiêu: Theo dõi ảnh hưởng của việc cung cấp oxi trong quá trình lên men sinh ethanol
* Bố trí thí nghiệm
- Dùng 50 ml dịch thủy phân thu được từ thí nghiệm ở mục 2.3.6, có bổ sung hoặc không bổ sung dịch chiết nấm men và pepton, pH chưa hấp khử trùng là 5,79 cho vào bình tam giác 250 ml và đậy lại bằng nút bông. Sau đó, mang đi hấp khử trùng ở 1210C, trong thời gian 15 phút.
- Dùng 50 ml dung dịch glucose 6%, không bổ sung dịch chiết nấm men và pepton, pH chưa hấp khử trùng là 5,79 cho vào bình tam giác 250 ml và đậy lại bằng nút bông. Sau đó, mang đi hấp khử trùng ở 1210C, thời gian 15 phút.
- Bổ sung 2 ml dịch tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae và
Pichia stipitis có mật độ 109 tế bào/ml. Lắc trên máy lắc với hai mức vận tốc