Kết thúc từng thời điểm của quá trình thủy phân ta xác định khối lượng rơm sau khi thủy phân, từ đó tính được hiệu suất của quá trình thủy phân rơm theo các mốc thời gian theo dõi. Kết quả được ghi nhận theo bảng 3.4.
Bảng 3.4: Hiệu suất của quá trình thủy phân rơm Thời gian
thủy phân (ngày)
Khối lượng rơm trước thủy phân
(g)
Khối lượng rơm sau thủy phân
(g)
Hiệu suất quá trình thủy phân rơm
(%) 3 1,000 0,8987 10,13± 0,03 5 1,000 0,8214 17,86 ± 0,05 7 1,000 0,8112 18,8 ± 0,10 9 1,000 0,8067 19,33± 0,19 11 1,000 0,8078 19,22± 0,14 13 1,000 0,8065 19,35 ± 0,18
Từ kết quả ghi nhận ở bảng 3.4 vẽ được đồ thị biểu diễn hiệu suất của quá trình thủy phân rơm.
19.35 19.22 19.33 18.88 17.86 10.13 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 3 5 7 9 11 13
Thời gian (ngày)
H iệ u s u ất ( % ) Hiệu suất (%)
Hình 3.5: Đồ thị biểu diễn hiệu suất quá trình thủy phân rơm
Dựa vào kết quả của bảng 3.4 và hình 3.5 ta nhận thấy, hiệu suất của quá trình thủy phân của ngày thứ 5 (17,86 ± 0,05%) cao hơn hiệu suất thủy phân của ngày thứ 3 (10,13± 0,03%) và càng tăng trong các ngày tiếp theo, tuy nhiên, hàm lượng đường khử ở ngày thứ 5 là cao nhất. Nhìn chung kết quả cho thấy là hiệu suất thủy phân thấp. Điều này có thể do trong thí nghiệm không thực hiện quá trình tiền thủy phân nguyên liệu ban đầu và lượng lignin trong nguyên liệu cũng là một yếu tố ức chế hoạt động của các loại enzyme tham gia thủy phân.
Hàm lượng đường khử và hoạt tính enzyme phân hủy cellulose đều giảm sau 5 ngày nhưng hiệu suất thủy phân cực đại sau 5 ngày và không đổi là do ở giai đoạn này lượng đường khử được tạo ra nấm mốc đã sử dụng nhưng vẫn chưa hết lượng đường được thủy phân từ rơm. Do cơ chế kiềm hãm giữa cơ chất và enzyme, lúc này enzyme sẽ bị ức chế bởi cơ chất nên hiệu suất thủy phân rơm không tăng.
So sánh với đối chứng là không bổ sung nấm mốc vào dung dịch hỗn hợp rơm ban đầu, bằng cách xác định hàm lượng đường khử tạo ra trong quá trình thủy phân. Kết quả cho thấy không có đường, tuy nhiên có sự phân hủy tự nhiên của rơm theo thời gian, nhưng chưa phân cắt để tạo thành đường.
3.2. Khảo sát ảnh hưởng của mật độ bào tử mốc đến hàm lượng đường khử trong quá trình thủy phân rơm
3.2.1. Hàm lượng đường khử theo các kiểu mật độ bào tử mốc
Mục tiêu của thí nghiệm là xác định mật độ bào tử mốc thích hợp bổ sung vào môi trường thủy phân để thu được hàm lượng đường khử nhiều nhất ở các kiểu mật độ bào tử bố trí thí nghiệm. Thí nghiệm được bố trí như mô tả ở mục 2.3.2, không điều chỉnh pH hỗn hợp ban đầu, kết quả thu được hàm lượng đường khử tạo ra như bảng 3.5
Bảng 3.5: Hàm lượng đường khử được tạo ra theo mật độ bào tử mốc Mật độ bào tử mốc (bào tử/ml) Hàm lượng đường khử (mg/g rơm) 106 14,53± 0,51 107 18,15± 0,47 108 15,83 ± 0,19
Dựa vào kết quả của bảng 3.5 ta thấy, hàm lượng đường khử ở thí nghiệm có bổ sung mật độ bào tử mốc là 107 có sự sai khác với hàm lượng đường khử ở thí nghiệm có bổ sung mật độ bào tử mốc là 108, hàm lượng đường khử ở thí nghiệm có bổ sung mật độ bào tử mốc là 106 có sự sai khác với hàm lượng đường khử ở thí nghiệm có mật độ bổ sung mật độ bào tử mốc là 107. Có sự sai khác về kết quả hàm lượng đường khử được tạo ra ở thí nghiệm có bổ sung mật độ bào tử mốc 106 ,107 và thí nghiệm có bổ sung mật độ bào tử mốc 108. Hàm lượng đường khử được tạo ra ở thí nghiệm có bổ sung mật độ bào tử mốc 107 là (18,15± 0,47 mg/g rơm) không có sự khác biệt nhiều so với hàm lượng đường khử được tạo ra ở thí nghiệm 1 (17,62 ± 0,76 mg/g rơm) ở cùng điều kiện thí nghiệm. Hàm lượng đường khử được tạo ra ở thí nghiệm có bổ sung mật độ bào tử mốc 106 là (14,53 ± 0,51 mg/g rơm) và hàm lượng đường khử được tạo ra ở thí nghiệm có bổ sung mật độ bào tử mốc 108 là (15,83 ± 0,19 mg/g rơm) thấp hơn hàm lượng đường khử được tạo ra ở thí
nghiệm 3.1 (17,62 ± 0,76 mg/g rơm) ở cùng điều kiện thí nghiệm về thời gian, chỉ khác nhau về mật độ bào tử mốc bổ vào quá trình thủy phân. Vì vậy, từ những kết quả trên ta chọn thí nghiệm có bổ sung mật độ bào tử mốc là mức 107 bào tử/ml.
3.2.2. Hoạt tính enzym cellulase và xylanase
Tương tự như thí nghiệm khảo sát yếu tố thời gian, tiến hành xác định hoạt tính enzym cellulase và xylanase, kết quả được trình bày ở bảng 3.6
Bảng 3.6: Hoạt tính enzym cellulase và xylanase Mật độ bào tử mốc (bào tử/ml) Hoạt tính enzyme cellulase (IU/ml) Hoạt tính enzyme xylanase (IU/ml) 106 0,15± 0,01 0,22± 0,04 107 0,27 ± 0,01 0,52 ± 0,01 108 0,20 ± 0,02 0,30± 0,04
Từ bảng 3.6 vẽ được biểu đồ biểu diễn hoạt tính enzyme cellulase và xylanase được tạo ra theo các kiểu mật độ bào tử mốc như sau
0.15 0.20 0.22 0.52 0.30 0.27 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 Mật độ bào tử mốc (bào tử/ml) H o ạ t tí n h e n z y m e c e ll u la s e v à x y la n a s e ( U I/ m l)
Họat tính enzyme cellulase (IU/ml) Hoạt tính enzyme xylanase (IU/ml)
Hình 3.6: Biểu đồ biểu diễn hoạt tính cellulase, xylanase theo mật độ bào tử mốc
106 107
Dựa vào kết quả bảng 3.6 và hình 3.6 ta nhận thấy hoạt tính enzyme cellulase được tạo ra ở thí nghiệm có bổ sung mật độ bào tử mốc là 107 có hoạt tính cao nhất (0,27± 0,01 IU/ml) và hoạt tính enzyme xylanse được tạo ra ở thí nghiệm có bổ sung mật độ bào tử mốc là 107 có hoạt tính cao nhất (0,52 ± 0,01 IU/ml). Kết quả hoạt tính của enzyme cellulase và xylanase trong thí nghiệm 3.2 tương đương với hoạt tính của enzyme cellulase và xylanase ở thí nghiệm 3.1 với cùng điều kiện thí nghiệm.
3.2.3. Hiệu suất của quá trình thủy phân rơm
Kết thúc quá trình thủy phân ta xác định khối lượng rơm sau khi thủy phân, từ đó tính được hiệu suất của quá trình thủy phân rơm theo các mức mật độ bào tử được bổ sung. Kết quả được ghi nhận theo bảng 3.7
Bảng 3.7: Hiệu suất của quá trình thủy phân rơm Mật độ bào tử mốc
(bào tử/ml)
Khối lượng rơm trước thủy phân
(g)
Khối lượng rơm sau thủy phân
(g)
Hiệu suất quá trình thủy phân rơm
(%)
106 1,000 0,8215 17,85± 0,03
107 1,000 0,8015 19,85± 0,04
108 1,000 0,8209 17,91± 0,09
Dựa vào kết quả của bảng 3.7 ta nhận thấy, hiệu suất quá trình thủy phân của thí nghiệm có mật độ bào tử mốc bổ sung 107 là cao nhất (19,85 ± 0,04 %) cao hơn hiệu suất thủy phân của các thí nghiệm còn lại.
3.3. Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố pH ban đầu đến hàm lượng đường khử trong quá trình thủy phân rơm
3.3.1. Hàm lượng đường khử
Mục tiêu của thí nghiệm là theo dõi ảnh hưởng của pH trong quá trình thủy phân rơm, để xác định pH tối ưu và thu được hàm lượng đường khử cao nhất. Thí nghiệm được bố trí như mô tả ở mục 2.3.3, điều chỉnh pH hỗn hợp
ban đầu bằng dung dịch đệm Na-acetate 0,1 M, pH = 4,5. Kết quả thu được hàm lượng đường khử tạo ra trong thời gian 5 ngày như bảng 3.8
Bảng 3.8: Hàm lượng đường khử tạo ra tương ứng với các giá trị pH ban đầu khác nhau trong quá trình thủy phân rơm
Hàm lượng đường khử (mg/g rơm) pH
4,0 4,5 5,0 5,5
10,98 ± 0.63 19,78 ± 0.63 7,11 ± 0.37 6,13 ± 0.32 Từ kết quả bảng 3.8 ta nhận thấy, hàm lượng đường khử tạo ra ở điều kiện pH 4,5 là cao hơn so với pH 4,0; 5,0 và 5,5. Hàm lượng đường khử được tạo ra ở pH 4,0; 5,0 và 5,5 là có sự khác biệt, nhưng hàm lượng đường khử tạo ra thấp. Điều này được giải thích như sau do pH dịch thủy phân được điều chỉnh ban đầu ở các mức là 4,0; 4,5; 5,0; 5,5 nhưng bắt đầu từ ngày thứ 3, pH của các thí nghiệm đã tăng lên 7.17, nên không thích hợp cho enzyme hoạt động. Ở pH 4,5 có hàm lượng đường khử được tạo ra là do giai đoạn đầu pH môi trường chưa tăng.
3.3.2. Hoạt tính enzyme cellulase
Hoạt tính enzym cellulase và xylanse cũng được xác định trong quá trình thủy phân rơm. Kết quả xác định hoạt tính enzym cellulase được trình bày ở bảng 3.9
Bảng 3.9: Hoạt tính enzym cellulase
Hoạt tính cellulase (IU/ml) pH
4,0 4,5 5,0 5,5
Kết quả ở bảng 3.9 cho thấy các hoạt tính enzym cellulase thí nghiệm có pH ban đầu 4,5 cao hơn ở các giá trị pH khác. Ở các giá trị pH khác enzym vẫn hoạt động nhưng hoạt tính giảm. Sự thay đổi hoạt tính cellulase ở các giá trị pH khảo sát có thể giải thích như sau: Mỗi enzym có khoảng pH hoạt động và điểm pH tối ưu đặc trưng. Protein enzym gồm nhiều amino acid, một số amino acid dễ bị phân cực như histidine, aspartic, glutamic, cysteine,…nên ở pH khác nhau điện tích của nó sẽ thay đổi. Sự thay đổi này có thể ảnh hưởng đến trung tâm hoạt động của enzym, ảnh hưởng đến sự gắn kết enzym và cơ chất. Do đó ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme.
Theo Fatma (2010), pH < 4,8 và pH > 4,8 là không phù hợp cho enzyme được sản xuất từ nấm mốc Trichoderma reesei, hoạt tính enzyme cellulase đạt 15,10 IU/g rơm ở pH tối ưu là 4,8 [16]. Theo kết quả từ bảng 3.9 mức pH của môi trường cho thấy giá trị pH tối ưu cho việc sản xuất enzyme cellulase được thu thập ở pH 4,5. pH tối ưu là rất quan trọng cho sự phát triển của các vi sinh vật và các hoạt động trao đổi chất của nó. Do các hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật rất nhạy cảm với thay đổi độ pH, cellulase sản xuất bởi Trichoderma reesei bị ảnh hưởng bởi sự thay đổi pH của môi trường. Cellulase từ
Trichoderma reesei làm việc tốt hơn trong môi trường axit (4,5-5,0) và sản xuất cellulase tối đa ở pH 4,5 [38].
3.3.3. Hoạt tính enzyme xylanase
Độ pH < 3,5 và pH > 6,5 không thích hợp cho enzyme được sản xuất từ nấm Trichoderma reesei. Dữ liệu minh họa rằng các enzyme có thể được hoạt động tối ưu ở pH 4,8. Xylanase sản xuất từ Trichoderma reesei rut C-30 đã được khảo sát tại các giá trị khác nhau ban đầu pH (4,8, 5,9 và 7,0) có bổ sung rơm trong điều kiện lắc trên máy lắc, và trong bình lên men, để xác định điều kiện pH tốt nhất. Theo nghiên cứu của Colina và cộng sự thì hoạt tính xylanase tối đa là 92 và 122 IU/ml, đạt ở pH 4,8 trong điều kiện lắc và trong bình lên men, trong đó sự phát triển tốt của nấm đã được quan sát trong 24 giờ đầu và sự tiêu thụ protein hòa tan từ rơm gây ra độ pH tăng lên đến giá trị từ 6,4 và 6,7 (tối ưu cho sản xuất xylanase) [12].
Bảng 3.10: Hoạt tính enzyme xylanse
Hoạt tính enzyme xylanse (IU/ml) pH
4,0 4,5 5,0 5,5
2,56± 0,02 2,59± 0,02 2,89± 0,11 3,79± 0,01 Hoạt tính xylanase tăng cao bắt đầu ở giá trị pH ban đầu là 5,0 và tiếp tục tăng ở giá trị pH là 5,5. Ở các giái trị pH khác xylanase vẫn hoạt động nhưng hoạt tính không cao. Sự thay đổi hoạt tính enzyme xylanase ở các giá trị pH khảo sát cũng có thể giải thích như sự thay đổi hoạt tính enzyme cellulase ở các giá trị pH khảo sát được trình bày
Theo Howard (2003), Trichoderma reesei sản xuất enzyme endo -1,4 - beta xylanase với hoạt tính riêng 6630 (μmol/min/mg) là tối ưu ở pH = 5 [20].
3.3.4. Hiệu suất của quá trình thủy phân rơm
Kết thúc quá trình thủy phân ta xác định khối lượng rơm sau khi thủy phân, từ đó tính được hiệu suất của quá trình thủy phân rơm ở các giá trị pH khác nhau. Kết quả được ghi nhận theo bảng 3.11
Bảng 3.11: Hiệu suất thủy phân rơm ở các điều kiện pH khác nhau
Hiệu suất thủy phân (%) pH
4,0 4,5 5,0 5,5
18,79± 0,04 19,79 ± 0,21 18,89± 0,11 18,53 ± 0,21 Từ các kết quả ghi nhận ở bảng 3.11 ta thấy hiệu suất thủy phân ở điều kiện pH = 4,5 là cao nhất so với các điều kiện pH = 4,0; 5,0 và 5,5
3.4. Khảo sát hàm lượng đường khử tạo rạ khi sử dụng và không sử dụng dung dịch đệm Na-acetate trong quá trình thủy phân rơm
3.4.1. Hàm lượng đường khử
Khảo sát ảnh hưởng của độ pH trong quá trình thủy phân giá trị pH tối ưu để enzyme hoạt động là pH 4,8. pH tối ưu rất quan trọng cho sự phát triển và hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật. Hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật rất nhạy cảm với sự thay đổi của pH, cellulase sản xuất bởi Trichoderma reesei bị ảnh hưởng bởi thay đổi pH của môi trường. Sản lượng đường tối ưu thu được ở pH 4,8. pH là một trong những yếu tố quan trọng nhất cho bất kỳ quá trình lên men mà phụ thuộc vào vi sinh vật vì mỗi vi sinh vật thích nghi một khoảng pH cho sự phát triển và hoạt động của nó. Tăng hoặc giảm giá trị pH tối ưu đều ảnh hưởng đến kết quả của sản phẩm lên men.
Từ kết quả thu được ở thí nghiệm 3.1 cho thấy pH dịch thủy phân bắt đầu tăng trên 7 ở ngày thứ 3, ở điều kiện pH > 7 không phù hợp cho enzyme hoạt động và ở thí nghiệm 3.3 cho kết quả về hàm lượng đường khử cao nhất khi điều chỉnh pH ban đầu là 4,5, nên tiến hành thí nghiệm với việc sử dụng dung dịch đệm Na-acetate 0,1 M, pH 4,5. Thí nghiệm được bố trí như mô tả ở mục 2.3.4, kết quả thu được hàm lượng đường khử được tạo ra theo mốc thời gian 5 ngày như bảng 3.12
Bảng 3.12: Hàm lượng đường khử tạo ra khi sử dụng và không sử dụng dung dịch đệm Na-acetate
Nghiệm thức Hàm lượng đường
khử (mg/g rơm)
Không dùng đệm Na-acetate, điều chỉnh pH ban đầu là 4,5 17,34 ± 0,58 Dùng dung dịch đệm Na-acetate 0,1M, pH = 4,5 20,35 ± 0,87
Từ kết quả bảng 3.12 ta thấy hàm lượng đường khử ở thí nghiệm dùng dung dịch đệm Na-acetate 0,1M, pH = 4,5 là cao hơn so với hàm lượng đường khử khi không sử dụng dung dịch đệm Na-acetate 0,1M, pH = 4,5.
3.4.2. Hoạt tính enzyme cellulase và xylanase
Hoạt tính enzym cellulase và xylanse cũng được xác định trong quá trình thủy phân rơm. Kết quả xác định hoạt tính enzym cellulase và xylanase được trình bày ở bảng 3.13
Bảng 3.13: Hoạt tính enzym cellulase và xylanase tạo ra khi sử dụng và không sử dụng dung dịch đệm Na-acetate
Nghiệm thức Hoạt tính cellulase (IU/ml) Hoạt tính xylanase (IU/ml) Không sử dụng dung dịch đệm
Na-acetate 0,1M, pH = 4,5 0,60 ± 0,01 2,68 ± 0,03
Sử dụng dung dịch đệm
Na-acetate 0,1M, pH = 4,5 0,84 ± 0,01 3,38 ± 0,08
Từ bảng 3.13 vẽ được biểu đồ biểu diễn hoạt tính enzyme cellulase và xylanase được tạo ra trong quá trình thủy phân rơm
2.68 0.60 3.38 0.84 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 Không sử dụng Sử dụng Dung dịch đệm Na-acetate 0,1M, pH = 4,5 H o ạt t ín h e n zy m e ce ll u la se và x yl an as e (I U /m l)
Hoạt tính cellulase (IU/ml) Hoạt tính xylanase (IU/ml)
Hình 3.7: Biểu đồ biểu diễn hoạt tính enzym cellulase và xylanase tạo ra khi sử dụng và không sử dụng dung dịch đệm Na-acetate
Qua các thí nghiệm trên ta thấy vai trò của dung dịch đệm Na-acetate 0,1M, pH = 4,5 góp phần làm ổn định giá trị pH, tạo điều kiện thuận lợi cho hoạt động của các enzyme trong quá trình thủy phân.
3.4.3. Hiệu suất phản ứng thủy phân rơm
Kết thúc quá trình thủy phân ta xác định khối lượng rơm sau khi thủy phân, từ đó tính được hiệu suất của quá trình thủy phân rơm. Kết quả được ghi