Cùng với việc theo dõi hàm lượng đường khử được tạo ra, tiến hành xác định hoạt tính của enzyme cellulase và xylanse. Kết quả xác định hoạt tính enzym cellulase và xylanse được trình bày ở bảng 3.19
Bảng 3.19: Hoạt tính enzym cellulase và xylanase sau 5 ngày Hoạt tính cellulase (IU/ml) Hoạt tính xylanase (IU/ml)
0,91 ± 0,01 3,48 ± 0,02
3.7. Lên men ethanol trong điều kiện cung cấp oxi với hai mức độ khác nhau với chủng Saccharomyces cerevisiae và Pichia stipitis
Trong nghiên cứu này, dịch thủy phân sau thời gian thủy phân rơm 5 ngày với nấm mốc Trichoderma reesei VTT-D-8013, dịch thủy phân được lọc và ly tâm với vận tốc 5000 vòng/phút trong thời gian 10 phút. Sau đó, xác định hàm lượng đường khử trong dịch thủy phân bằng phương pháp DNS. Kết quả đo được hàm lượng đường khử là 21,9 ± 0,12 mg/g nguyên liệu rơm. Nồng độ glucose trong dịch thủy phân dùng để lên men là 0,1 g/l.
Sử dụng 50 ml glucose 6% và 50 ml dịch thủy phân có hoặc không có bổ sung peptone và dịch chiết nấm men, cho lên men lần lượt với hai chủng
Saccharomyces cerevisiae và Pichia stipitis trong thời gian 4 ngày và lắc trên máy lắc với hai vận tốc khác nhau, ở điều kiện nhiệt độ phòng. Trong số các nghiệm thức được bố trí, sau thời gian 4 ngày thu dịch lên men và xác định hàm lượng ethanol bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp, có 4 nghiệm thức cho kết quả của quá trình lên men sinh ethanol đó là nghiệm thức 1, nghiệm thức 4, nghiệm thức 5, nghiệm thức 6 với kết quả như sau:
Theo bảng 3.25 đối với glucose 6% thì ở nghiệm thức 1 cho kết quả hàm lượng ethanol 5,07 g/l cao hơn nghiệm thức 6 cho kết quả hàm lượng ethanol 4,64 g/l. Theo Peiris (1987) đường khử được tạo ra bởi enzyme thủy phân rơm chủ yếu là glucose, xylose và cellobiose. Sản lượng ethanol được tạo ra từ lượng đường khử 4,8% (w/v) của dịch thủy phân rơm bởi nấm men
Saccharomyces cerevisiae 0.6% (w/v) là 10,7 g/1 ethanol và sản lượng ethanol được tạo ra là 18,8 g/1 từ 4,8% (w/v) glucose tinh khiết [29].
Thí nghiệm sử dụng dịch thủy phân có bổ sung pepton và dịch chiết nấm men lên men với giống Pichia stipitis và Sacharomyces cerevisiae với vận tốc
lắc 100 vòng/phút. Kết quả thu được hàm lượng ethanol từ việc lên men dịch thủy phân với giống Pichia stipitis là 40 mg/l và giống Sacharomyces cerevisiae là 69 mg/l. Kết quả này cho thấy tốc độ lắc tương ứng với việc cung cấp oxi khác nhau cũng ảnh hưởng đến khả năng tạo ethanol. Hàm lượng ethanol ở nghiệm thức 4 và 5 thấp hơn nghiệm thức 1 và 6 là do hàm lượng đường trong dịch thủy phân ban đầu thấp 21,9 ± 0,12 mg/g nguyên liệu rơm.
Bảng 3.20: Kết quả nồng độ ethanol NT Thành phần dịch thủy phân Thời gian lưu (h) Diện tích peak Nông độ (g/l)
1 ** Glucose (6%) + Saccharomyces cerevisiae 17,696 1705005 5,07
2 ** Dịch thủy phân + Saccharomyces cerevisiae - - -
3 ** Dịch thủy phân + Pichia stipitis - - -
4 ** Dịch thủy phân Dịch chiết nấm men Pepton 17,129 232032 0,69 5 ** Dịch thủy phân Dịch chiết nấm men Pepton 17,717 11410 0,04
6 * Glucose (6%) + Saccharomyces cerevisiae 17,656 1559095 4,64
7 * Dịch thủy phân + Saccharomyces cerevisiae - - -
8 * Dịch thủy phân + Pichia stipitis - - -
9 * Dịch thủy phân Dịch chiết nấm men Pepton - - - 10 * Dịch thủy phân Dịch chiết nấm men Pepton - - - * Lắc 50 vòng/phút ** Lắc 100 vòng/phút + Pichia stipitis + S. cerevisiae + Pichia stipitis + S. cerevisiae
Theo bảng 3.25 đối với glucose 6% thì ở nghiệm thức 1 cho kết quả hàm lượng ethanol 5,07 g/l cao hơn nghiệm thức 6 cho kết quả hàm lượng ethanol 4,64 g/l. Theo Peiris (1987) đường khử được tạo ra bởi enzyme thủy phân rơm chủ yếu là glucose, xylose và cellobiose. Sản lượng ethanol được tạo ra từ lượng đường khử 4,8% (w/v) của dịch thủy phân rơm bởi nấm men
Saccharomyces cerevisiae 0.6% (w/v) là 10,7 g/1 ethanol và sản lượng ethanol được tạo ra là 18,8 g/1 từ 4,8% (w/v) glucose tinh khiết [29].
Thí nghiệm sử dụng dịch thủy phân có bổ sung pepton và dịch chiết nấm men lên men với giống Pichia stipitis và Sacharomyces cerevisiae với vận tốc lắc 100 vòng/phút. Kết quả thu được hàm lượng ethanol từ việc lên men dịch thủy phân với giống Pichia stipitis là 40 mg/l và giống Sacharomyces cerevisiae là 69 mg/l. Kết quả này cho thấy tốc độ lắc tương ứng với việc cung cấp oxi khác nhau cũng ảnh hưởng đến khả năng tạo ethanol. Hàm lượng ethanol ở nghiệm thức 4 và 5 thấp hơn nghiệm thức 1 và 6 là do hàm lượng đường trong dịch thủy phân ban đầu thấp 21,9 ± 0,12 mg/g nguyên liệu rơm.
Việc cung cấp khí oxy ở hai mức khác nhau trong quá trình lên men có ảnh hưởng đến hiệu suất quá trình lên men. Quá trình lên men ở giai đoạn đầu cung cấp oxy là để tăng sinh khối nấm men, giai đoạn giảm oxy để lên men. Tuy nhiên, trong thí nghiệm vẫn giữ mức độ cung cấp oxy trong suốt quá trình dẫn đến hiệu suất lên men thấp.
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN & ĐỀ NGHỊ
4.1 Kết luận
Từ kết quả thí nghiệm khảo sát các yếu tố về thời gian thủy phân, mật độ bào tử mốc, dung dịch đệm pH 4,5 và chất hoạt động bề mặt trong quá trình thủy phân. Kết hợp các điều kiện thí nghiệm trên đã rút ra kết luận sau:
% bã rắn : 1%
Mật độ bào tử mốc : 107 bào tử/ml
Tween-80 : 0,1%
pH : 4,5
Vận tốc khuyấy : 100 vòng/phút
Thời gian : 5 ngày
Kết quả thu được từ việc thủy phân 5 g rơm rạ trong bình lên men ở nhiệt độ phòng kết quả thu được hàm lượng đường khử là 21,9 ± 0,12 mg/g.
Thí nghiệm sử dụng dịch thủy phân có bổ sung pepton và dịch chiết nấm men lên men với giống Pichia stipitis và Sacharomyces cerevisiae với vận tốc lắc 100 vòng/phút. Kết quả thu được hàm lượng ethanol từ việc lên men với giống Pichia stipitis là 40 mg/l và giống Sacharomyces cerevisiae là 69 mg/l.
4.2 Đề nghị
Để sử dụng nguồn nguyên liệu lignocellulose trong sản xuất bioethanol có hiệu quả hơn tác giả có một số đề nghị sau
Quá trình thủy phân nên sử dụng enzyme để thủy phân rơm rạ hơn là sử dụng trực tiếp vi sinh vật. Những kết quả từ nghiên cứu này cũng đã phần nào chứng minh khả năng tạo ra đường khử tuy nhiên hàm lượng đường thấp.
Nếu như sử dụng vi sinh vật để thủy phân thì phải có buớc tiền xử lý để quá trình thủy phân hiệu quả hơn.
Nghiên cứu để nâng cao hiệu quả của quá trình tiền xử lý là cần thiết. Tiếp tục khảo sát quá trình lên men từ Pichia stipitis.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Phạm Thị Ánh Hồng (2003), Kỹ thuật sinh hóa, Nxb Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh.
[2] Phạm Thị Ánh Hồng (2009), Tài liệu thực tập kỹ thuật sinh hóa, Bộ môn sinh hóa, Lưu hành nội bộ.
[3] Nguyễn Văn Mùi (2001), Thực hành hóa sinh học, Nxb Khoa học và Kỹ Thuật Hà Nội.
[4] Nguyễn Đức Lượng (2006), Công nghệ vi sinh tập 2, Nxb Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh.
[5] Trần Diệu Lý (2008), Nghiên cứu sản xuất ethanol nhiên liệu từ rơm rạ, Luận văn tốt nghiệp Đại học, Trường Đại học Bách khoa,Tp.Hồ Chí Minh.
[6] Đồng Thị Thanh Thu (2002), Giáo trình sinh hóa cơ bản, Tủ sách Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh.
[7] Trần Linh Thước (2005), Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực
phẩm và mĩ phẩm, Nhà xuất bản Giáo dục.
Tài liệu Tiếng Anh
[8] Arja, M. O., (2004), Trichoderma reesei strains for production of cellulases for
the textile industry, Espoo 2004, VTT Publication 550.
[9] Allan M.W., Danny L.R., Krishan K., Klein K.K. 2006. Policies to stimulate biofuel production in Canada: Lessons from Europe and the United States. A BIOCAP research integration program synthesis paper.
[10] Barton, F. E. (1988), Chemistry of Lignocellulose: Methods of Analysis
and Consequences of Structure, Animal Feed Science and Technology, 21,
pp. 279-286.
[11] Chandrakant, P., Bisaria, V.S., (1998), Simultaneous Bioconversion of Cellulose and Hemicellullose to Ethanol, Critical Reviews in Biotechnology, 18 (4), pp. 295-331.
[12] Castanon, M., Wilke, C. R., (1981), Effects of the surfactant tween 80 on enzymatic hydrolysis of newspaper, Biotechnology and Bioengineering, vol 23, pp. 1365–1372.
[13] Colina, A et al., (2003), Xylanase production by Trichoderma reesei rut C-30 on rice straw, Applied Biochemistry Biotechnology, vol 108, pp. 1-3.
[14] Charles, E.W., (1996), Handbook on Bioethanol: Product and Utilization, Taylor&Francis, pp. 119-285.
[15] Demirbas, A., (2007), Producing and using bioethanol as an automotive fuel. Energy sources Part B, 2, pp. 391-401.
[16] Fatma, H. Abd El-Zaher and Fadel., (2010), Production of Bioethanol Via Enzymatic Saccharification of Rice Straw by Cellulase Produced by Trichoderma Reesei Under Solid State Fermentation, New York Science Journal.
[17]. Faaij, A., (2006), Modern biomass conversion technologies, Mitigation and
Adaptation Strategies for Global Change, 11, pp. 343 – 375.
[18] Gray, K. A., Zhao, L. and Emptage, M., (2006), Bioethanol, Current Opinion in Chemical Biology, 10, pp. 1–6.
[19] Greenergy International Limited. 2007. Bioethanol - a greenergy perspective. London.
[20] Howard, R. L et al., (2003), Lignocellulose biotechnology: issues of biocon- version and enzyme production, African Journal of Biotechnology, Vol. 2 (12),
pp. 602-619.
[21] Isci (2008), A rapid Simultaneous Saccharification and Fermentation (SSF) Technique to Determine Ethanol Yields, Department of Agricultural and
Biosystems Engineerring,1, pp. 163 – 169.
[22] Kocher, G. S., Kalra, K. L., Banta, G., (2008), Optimization of cellulase production by submerged fermentation of rice straw by Trichoderma
harzianum Rut-C 8230, The Internet Journal of Microbiology. Volume 5 Number 2.
[23] Kristensen, J.B., (2009), Enzymatic hydrolysis of lignocellulose subtracte interactions and high solid loadings, Forest & Landscape Research No. 42, Frederiksberg.
[24] Kaya, F., Heitmann, Jr J. A., and Joyce, T. W., (1995), Influence of surfact ants on the enzymatic hydrolysis of xylan and cellulose, Biotechnology, Vol. 78, No. 10, pp.150-157.
[25] Kuhls K.et al., (1996), Molecular evidence that the asexual industrial fungus Trichoderma reesei is a clonal derivative of the ascomycete, Hypocrea
jecorina, Pro. Natl. Acad.Sci. USA, Vol.93, pp. 7755 – 7760.
[26] Nigam, J. N., (2001), Development of xylose-fermenting yeast Pichia stipitis for ethanol production through adaptation on hardwood hemicellulose acid prehydrolysate, Journal of Applied Microbiology, 90, pp. 208 – 215.
[27] Lynd, L.R., (1996), Overview and evaluation of fuel ethanol from cellulosic biomass: technology, economics, the environment and policy. Annual
Review of Energy and Environment, 21, pp. 403–465.
[28] Palonen, H., (2004), Role of lignin in the enzymatic hydrolysis of
lignocellulose, VTT Publications 520,
[29] Peiris, P. S, Silva, I., (1987), Hydrolysis of rice straw to fermentable sugars
by Trichoderma enzymes, MIRCENJournal, 3, pp. 57-65.
[30] Qin, W., (2010), High consistency enzymatic hydrolysis of lignocellulose, Master of applied science, the university of British Columbia.
[31] Rouhollah, H., Iraj, N., Giti, E., Sorah, A., (2007), Mixed sugar fermentation by Pichia stipitis, Sacharomyces cerevisiaea, and an isolated xylose- fermenting Kluyveromyces marxianus and their cocultures, African Journal
of Biotechnology, Vol. 6 (9), pp. 1110 – 1114.
[32] Reesei, E.T., (1969), Surfactants as Stimulants of Enzyme Production by Microorganisms, Applied Microbiology, vol 17, pp. 242-245.
[33] Seema, J.P et al., (2007), Fungal pretreatment studies on rice husk and bagasse for ethanol production,. EJEAFChe, 6 (4), pp. 1921-1926.
[34] Slininger, P.J., Bothast. R.J. (1990), Optimum pH and Temperature
Conditions for Xylose Fermentation by Pichia stipitis, Biotech and Bioengineering, Vol. 35, pp, 727 – 731.
[35] Skoog, K., Hagerdal, B. H., (1990), Effect of Oxygenation on Xylose Fermentation by Pichia stipitis, Applied and environmental microbiology,
Vol. 56, No. 11, pp. 3389-3394.
[36] Skoog, K., Hagerdal, B. H., Degn, L.H., Jacobsen, J.P., Jacobsen, H. S., (1992), Ethanol Reassimilation and Ethanol Tolerance in Pichia stipitis CBS 6054 as Studied by 13C Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, Applied
and environmental microbiology, Vol. 58, No. 8, pp. 2552-2558.
[37] Salager, J.L., (2002), Surfactants typyes and Uses
[38]. Singh et al (2008), Biological pretreatment of sugarcane trash for its conver- sion to fermentable sugars, World J Microbiol Biotechnol, 24, pp. 667 – 673. [39] Tangnu, S.K, Blanch, H.W, Wilke, C. R., (1981), Enhanced Production of
Cellulase, Hemicellulase, and P-Glucosidase by Trichoderma reesei (Rut C- 30), Biotechnology and Bioengineering, Vol. 23, pp. 1837-1849.
[40] Tokgoz, S., (2008), The impact of energy markets on the EU agricultural sector. In: Proceedings of the 12th congress of the european association of agricultural economists- EAAE 2008, Ghent, Belgium, August 26-29.
[41] Xiong, H., (2004), Production and characterization of Trichoderma reesei and
Thermomyces lanuginosus xylanases, Helsinki University of Technology,
Department of Chemical Technology Laboratory of Bioprocess Engineering. [42] Yang, Y., (2008), Ethanol Production Potential of Acid Pretreated Switchgrass
Varieties, Biological and Agricultural Engineering.
[43] Yang, B., Lu, Y., (2006), Perspective the promise of cellulosic ethanol production in China. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 82, pp. 6-10.
[44] Yue, Z., WU Bin, YAN Baixu & GAO Peiji, (2004), Mechanism of cellobiose inhibition in cellulose hydrolysis by cellobiohydrolase Science in China Ser. C Life Sciences, Vol.47 No.1, pp. 18—24.
[45] Zarzyycki, A., Polska, W., (2007), Bioethanol production from sugar beet- European and Polish perspective. The first TOSSIE workshop on technology improvement opportunities in the European sugar industry, Ferrara, Italy, January 25-26.
Tài liệu internet
[46] http://www.entrepreneurstoolkit.org/index.php
[47] http://tintuconline.com.vn/vn/khoahoc/451383/index.html
[48] http://www.orientbiofuels.com.vn/index.php
[49] http://nhandan.com.vn
I. Thiết bị
1. Máy đông khô
2. Máy lắc tự chế - Việt Nam
3. Máy lắc KS250basic – IKA - LABORTECHNIK
4. Máy khuấy từ Yelloline MSH basic – Đức
5. Máy li tâm Jouan CR 412 – Pháp
6. Máy quang phổ Hewlett Packard 8453
7. Máy vortex, Máy pH 1299 – Apel
8. Cân phân tích HR-200 AND
9. Kính hiển vi quang học Olympus - Nhật Bản
10.Bể ổn nhiệt Memmert GmbH - Đức
11.Bộ điện di, Bếp từ, Lò vi song, Nồi hấp TomMySS-325 - Nhật Bản
12.Tủ cấy, Tủ lạnh, Tủ sấy
II. Dụng cụ
1. Bình tam giác, Bình định mức 50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml
2. Ống đong 100 ml, Pipet 1 ml, 10 ml
3. Micropipet 20 - 200 µl và 1000 µl
4. Cốc thủy tinh 250 ml, Đĩa petri 100 x 20
5. Đèn cồn, Đũa thủy tinh, Giấy lọc, Ống nghiệm, Que cấy
6. Phễu thủy tinh/nhựa
2.1. Phương pháp pha hóa chất
1. Dung dịch Tween 20, 10%: hòa tan 10 g Tween 20 với nước cất, thêm nước cất định mức đủ 100 ml
2. Dung dịch đệm Acetate 0,1M, pH 5,0 với 0,04 % Tween 20: Hòa tan 13,6 g CH3COONa.3H2O và 2,94 g CaCl2.2H2O với 900 ml nước cất. Điều chỉnh pH với HCl 25% đến pH 5,0 ± 0,02. Thêm 4 ml dung dịch Tween 20, định mức bằng nước cất đến 1000 ml.
3. Dung dịch NaOH/KOH: Hòa tan 80 g NaOH và 112 g KOH với nước cất, thêm nước cất định mức đủ 500 ml. Giữ dung dịch trong bình nhựa, ở nhiệt độ phòng.
4. Dung dịch acid 2-hydroxyl-3,5-dinitrobezoic (DNS): 5 g DNS hòa tan với 300 ml nước cất ở 50oC. Thêm 50 ml dung dịch NaOH/KOH trước khi thêm 150 g Potassium sodium tartrate tetrahudrate. Ổn định dung dịch ở nhiệt độ phòng, định mức bằng nước cất đủ 500 ml. Giữ dung dịch trong bình tối, ở nhiệt độ phòng.
5. Dung dịch gốc Glucose 0,1M: Cân 1,8 g D-Glucose (với Glucose Mw 180,16) chuyển vào bình định mức 100 ml, định mức bằng dung dịch đệm Acetate 0.1M, pH 5.0.
6. Dung dịch gốc Xylose 0,1M: Cân 1,5g D-Xylose (Xylose Mw150,13) chuyển vào bình định mức 100 ml, định mức bằng dung dịch đệm Acetate 0,1M, pH 5,0. 7. Dung dịch cơ chất CMC 2%: 2 g CMC hòa tan trong 80 ml dung dịch đệm Acetate 0,1M, pH 5,0, với 0,04% Tween 20 khuấy trên bếp cách thủy trong thời gian 10 phút. Làm mát ở nhiệt độ phòng, chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm dung dịch đệm Acetate 0.1M, pH 5.0 và định mức đủ 100 ml.
8. Dung dịch cơ chất Xylan 1%: 1g xylan hòa tan trong 80 ml dung dịch đệm Acetate 0,1M, pH 5,0, với 0,04% Tween 20 khuấy trên bếp cách thủy trong thời gian 10 phút. Làm mát ở nhiệt độ phòng, chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm dung dịch đệm Acetate 0.1M, pH 5.0 và định mức đủ 100 ml.
Bảng 1: Giá trị OD của dung dịch chuẩn glucose
Nồng độ glucose (µg/ml) 50 100 150 200 300
OD ở bước sóng 540 nm 0,008 0,022 0,036 0,051 0,079
Tư bảng 1 ve đồ thị biểu diên mối quan hệ nồng độ glucose – và giá trị OD như sau: 0.008 0.022 0.036 0.051 0.079 y = 0.0003x - 0.0064 R2 = 0.9999 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0 50 100 150 200 250 300 350 Nồng độ glucose (µg/ml) O D 5 40 n m
Nồng độ glucose (µg/ml) Linear (Nồng độ glucose (µg/ml))
Hình 1: Đồ thị đường chuẩn glucose
2.3. Đường chuẩn glucose xác định hoạt tính enzyme cellulase
Bảng 2: Giá trị OD của dung dịch chuẩn glucose
Nồng độ glucose (µg/ml) 50 100 150 200 300
OD ở bước sóng 540 nm 0,009 0,021 0,038 0,052 0,081
Tư bảng 2 ve đồ thị biểu diên mối quan hệ nồng độ glucose – và giá trị OD như sau:
y = 0.0003x - 0.0051 R2 = 0.9999 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0 50 100 150 200 250 300 350 Nồng độ glucose (µg/ml) O D 5 40 n m
Hình 2: Đồ thị đường chuẩn glucose
2.4. Đường chuẩn xylose xác định hoạt tính enzyme xylanase
Bảng 3: Giá trị OD của dung dịch chuẩn xylose
Nồng độ xylose (µg/ml) 50 100 150 200 300
OD ở bước sóng 540 nm 0,008 0,023 0,039 0,053 0,081
Tư bảng 3 ve đồ thị biểu diên mối quan hệ nồng độ xylose – và giá trị OD