Độ pH < 3,5 và pH > 6,5 không thích hợp cho enzyme được sản xuất từ nấm Trichoderma reesei. Dữ liệu minh họa rằng các enzyme có thể được hoạt động tối ưu ở pH 4,8. Xylanase sản xuất từ Trichoderma reesei rut C-30 đã được khảo sát tại các giá trị khác nhau ban đầu pH (4,8, 5,9 và 7,0) có bổ sung rơm trong điều kiện lắc trên máy lắc, và trong bình lên men, để xác định điều kiện pH tốt nhất. Theo nghiên cứu của Colina và cộng sự thì hoạt tính xylanase tối đa là 92 và 122 IU/ml, đạt ở pH 4,8 trong điều kiện lắc và trong bình lên men, trong đó sự phát triển tốt của nấm đã được quan sát trong 24 giờ đầu và sự tiêu thụ protein hòa tan từ rơm gây ra độ pH tăng lên đến giá trị từ 6,4 và 6,7 (tối ưu cho sản xuất xylanase) [12].
Bảng 3.10: Hoạt tính enzyme xylanse
Hoạt tính enzyme xylanse (IU/ml) pH
4,0 4,5 5,0 5,5
2,56± 0,02 2,59± 0,02 2,89± 0,11 3,79± 0,01 Hoạt tính xylanase tăng cao bắt đầu ở giá trị pH ban đầu là 5,0 và tiếp tục tăng ở giá trị pH là 5,5. Ở các giái trị pH khác xylanase vẫn hoạt động nhưng hoạt tính không cao. Sự thay đổi hoạt tính enzyme xylanase ở các giá trị pH khảo sát cũng có thể giải thích như sự thay đổi hoạt tính enzyme cellulase ở các giá trị pH khảo sát được trình bày
Theo Howard (2003), Trichoderma reesei sản xuất enzyme endo -1,4 - beta xylanase với hoạt tính riêng 6630 (μmol/min/mg) là tối ưu ở pH = 5 [20].
3.3.4. Hiệu suất của quá trình thủy phân rơm
Kết thúc quá trình thủy phân ta xác định khối lượng rơm sau khi thủy phân, từ đó tính được hiệu suất của quá trình thủy phân rơm ở các giá trị pH khác nhau. Kết quả được ghi nhận theo bảng 3.11
Bảng 3.11: Hiệu suất thủy phân rơm ở các điều kiện pH khác nhau
Hiệu suất thủy phân (%) pH
4,0 4,5 5,0 5,5
18,79± 0,04 19,79 ± 0,21 18,89± 0,11 18,53 ± 0,21 Từ các kết quả ghi nhận ở bảng 3.11 ta thấy hiệu suất thủy phân ở điều kiện pH = 4,5 là cao nhất so với các điều kiện pH = 4,0; 5,0 và 5,5
3.4. Khảo sát hàm lượng đường khử tạo rạ khi sử dụng và không sử dụng dung dịch đệm Na-acetate trong quá trình thủy phân rơm
3.4.1. Hàm lượng đường khử
Khảo sát ảnh hưởng của độ pH trong quá trình thủy phân giá trị pH tối ưu để enzyme hoạt động là pH 4,8. pH tối ưu rất quan trọng cho sự phát triển và hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật. Hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật rất nhạy cảm với sự thay đổi của pH, cellulase sản xuất bởi Trichoderma reesei bị ảnh hưởng bởi thay đổi pH của môi trường. Sản lượng đường tối ưu thu được ở pH 4,8. pH là một trong những yếu tố quan trọng nhất cho bất kỳ quá trình lên men mà phụ thuộc vào vi sinh vật vì mỗi vi sinh vật thích nghi một khoảng pH cho sự phát triển và hoạt động của nó. Tăng hoặc giảm giá trị pH tối ưu đều ảnh hưởng đến kết quả của sản phẩm lên men.
Từ kết quả thu được ở thí nghiệm 3.1 cho thấy pH dịch thủy phân bắt đầu tăng trên 7 ở ngày thứ 3, ở điều kiện pH > 7 không phù hợp cho enzyme hoạt động và ở thí nghiệm 3.3 cho kết quả về hàm lượng đường khử cao nhất khi điều chỉnh pH ban đầu là 4,5, nên tiến hành thí nghiệm với việc sử dụng dung dịch đệm Na-acetate 0,1 M, pH 4,5. Thí nghiệm được bố trí như mô tả ở mục 2.3.4, kết quả thu được hàm lượng đường khử được tạo ra theo mốc thời gian 5 ngày như bảng 3.12
Bảng 3.12: Hàm lượng đường khử tạo ra khi sử dụng và không sử dụng dung dịch đệm Na-acetate
Nghiệm thức Hàm lượng đường
khử (mg/g rơm)
Không dùng đệm Na-acetate, điều chỉnh pH ban đầu là 4,5 17,34 ± 0,58 Dùng dung dịch đệm Na-acetate 0,1M, pH = 4,5 20,35 ± 0,87
Từ kết quả bảng 3.12 ta thấy hàm lượng đường khử ở thí nghiệm dùng dung dịch đệm Na-acetate 0,1M, pH = 4,5 là cao hơn so với hàm lượng đường khử khi không sử dụng dung dịch đệm Na-acetate 0,1M, pH = 4,5.
3.4.2. Hoạt tính enzyme cellulase và xylanase
Hoạt tính enzym cellulase và xylanse cũng được xác định trong quá trình thủy phân rơm. Kết quả xác định hoạt tính enzym cellulase và xylanase được trình bày ở bảng 3.13
Bảng 3.13: Hoạt tính enzym cellulase và xylanase tạo ra khi sử dụng và không sử dụng dung dịch đệm Na-acetate
Nghiệm thức Hoạt tính cellulase (IU/ml) Hoạt tính xylanase (IU/ml) Không sử dụng dung dịch đệm
Na-acetate 0,1M, pH = 4,5 0,60 ± 0,01 2,68 ± 0,03
Sử dụng dung dịch đệm
Na-acetate 0,1M, pH = 4,5 0,84 ± 0,01 3,38 ± 0,08
Từ bảng 3.13 vẽ được biểu đồ biểu diễn hoạt tính enzyme cellulase và xylanase được tạo ra trong quá trình thủy phân rơm
2.68 0.60 3.38 0.84 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 Không sử dụng Sử dụng Dung dịch đệm Na-acetate 0,1M, pH = 4,5 H o ạt t ín h e n zy m e ce ll u la se và x yl an as e (I U /m l)
Hoạt tính cellulase (IU/ml) Hoạt tính xylanase (IU/ml)
Hình 3.7: Biểu đồ biểu diễn hoạt tính enzym cellulase và xylanase tạo ra khi sử dụng và không sử dụng dung dịch đệm Na-acetate
Qua các thí nghiệm trên ta thấy vai trò của dung dịch đệm Na-acetate 0,1M, pH = 4,5 góp phần làm ổn định giá trị pH, tạo điều kiện thuận lợi cho hoạt động của các enzyme trong quá trình thủy phân.
3.4.3. Hiệu suất phản ứng thủy phân rơm
Kết thúc quá trình thủy phân ta xác định khối lượng rơm sau khi thủy phân, từ đó tính được hiệu suất của quá trình thủy phân rơm. Kết quả được ghi nhận theo bảng 3.14
Bảng 3.14: Hiệu suất của quá trình thủy phân rơm
Nghiệm thức
pH = 4,5
Khối lượng rơm trước thủy phân
(g)
Khối lượng rơm sau thủy phân
(g)
Hiệu suất quá trình thủy phân rơm
(%)
NT 1 1,000 0,7900 21,00 ± 0,38
NT 2 1,000 0,8040 19,60 ± 0,28
NT1: Dùng dung dịch đệm Na-acetate 0,1M, pH = 4,5
NT2: Không dùng đệm Na-acetate, điều chỉnh pH ban đầu là 4,5
Trong nghiên cứu này, hiệu suất thủy phân rơm thu được từ thí nghiệm có dùng dung dịch đệm Na-acetate 0,1M, pH = 4,5 là cao hơn so với hiệu suất thủy phân khi không sử dụng dung dịch đệm Na-acetate 0,1M, pH = 4,5. Kết quả trên cho thấy vai trò của dung dịch đệm Na-acetate 0,1M, pH = 4,5 làm ổn định giá trị pH tạo điều kiện thuận lợi cho enzyme hoạt động.
3.5. Khảo sát ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt lên quá trình thủy phân rơm
3.5.1. Hàm lượng đường khử
Mục tiêu của thí nghiệm này là khảo sát ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt đến hàm lượng đường khử được tạo rạ trong quá trình thủy phân rơm. Từ thí nghiệm được bố trí ở mục 2.3.5, thu được kết quả hàm lượng đường khử theo bảng 3.15
Bảng 3.15: Hàm lượng đường khử tạo ra khi bổ sung và không bổ sung Tween- 80; 0,1%
Nghiệm thức Hàm lượng đường khử
(mg/g rơm)
Không bổ sung Tween-80; 0,1% 19,87 ± 0,39
Bổ sung Tween-80; 0,1% 21,86 ± 0,18
Trong nghiên cứu này, hàm lượng đường khử thu được từ thí nghiệm có bổ sung Tween-80, 0,1% là cao hơn so với thí nghiệm không bổ sung Tween- 80, 0,1%. Điều này cũng phù hợp những kết quả nghiên cứu về hoạt động của chất hoạt động bề mặt trong quá trình thủy phân. Trong thí nghiệm này có sử dụng Tween-80, 0,1% là một chất hoạt động bề mặt thuộc nhóm noninic có khả năng tăng tốc độ và mức độ đường hóa cellulose. Vì vậy, hàm lượng đường khử được tạo ra từ thí nghiệm có bổ sung Tween-80, 0,1% cao hơn hàm lượng đường khử từ thí nghiệm không bổ sung Tween-80, 0,1%.
3.5.2. Hoạt tính enzyme cellulase và xylanase
Cùng với việc theo dõi hàm lượng đường khử được tạo ra, ta tiến hành xác định hoạt tính của enzyme cellulase và xylanse. Kết quả xác định hoạt tính enzym cellulase và xylanse được trình bày ở bảng 3.16.
Bảng 3.16: Hoạt tính enzym cellulase và xylanase tạo ra khi bổ sung và không bổ sung Tween 80; 0,1%
Nghiệm thức Hoạt tính cellulase (IU/ml) Hoạt tính xylanase (IU/ml) Không bổ sung Tween 80; 0,1% 0,86 ± 0,03 2,72 ± 0,03
Bổ sung Tween 80; 0,1% 0,91 ± 0,01 3,48 ± 0,02 Từ bảng 3.16 vẽ được biểu đồ biểu diễn hoạt tính enzyme cellulase và xylanase như hình 3.8.
0.86 2.72 0.91 3.48 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00
Không bổ sung Bổ sung
Tween-80, 0,1% H o ạt t ín h e n zy m e ce llu la se và x yl an se ( IU /m l)
Hoạt tính cellulase (IU/ml) Hoạt tính xylanase (IU/ml)
Hình 3.8: Biểu đồ biểu diễn enzyme cellulase và xylanase tạo ra khi bổ sung và không bổ sung Tween 80; 0,1%
Chất hoạt động bề mặt như Tween 80, SDS, vv, đã được báo cáo để tăng cường hoạt tính của enzyme cellulase bằng cách tăng khả dụng của các chất dinh dưỡng. Cellulase có thể được sử dụng để đường hóa rơm để sản xuất ethanol sinh học, kết quả thử nghiệm 4 nồng độ của Tween 80 trong nghiên cứu và đã tìm thấy nồng độ 0,10% đã tăng cường các hoạt động cellulase. Tuy nhiên, sự ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt lên hoạt tính của enzyme xylanse ít được đề cặp đến nhưng kết quả thí nghiệm cho thấy hoạt tính của enzyme xylanse ở thí nghiệm có bổ sung Tween 80, 0,1% có hoạt tính cao hơn ở thí nghiệm không bổ sung Tween 80, 0,1% [21].
Các chất hoạt động bề mặt có thể sẽ tăng cường hoặc ức chế hoạt động của enzyme cellulose hoặc xylanase. Tween 80 là một chất hoạt động bề mặt có bản chất là nonionic là tăng cường hoạt động của enzyme. Xylanase và cellulase có thể được an toàn sử dụng cùng với chất hoạt động bề mặt có bản chất là nonionic trong quá trình thủy phân [24].
3.5.3. Hiệu suất phản ứng thủy phân rơm
Kết thúc quá trình thủy phân ta xác định khối lượng rơm sau khi thủy phân, từ đó tính được hiệu suất của quá trình thủy phân rơm. Kết quả được ghi nhận theo bảng 3.17
Bảng 3.17: Hiệu suất của quá trình thủy phân rơm
Nghiệm thức
pH = 4,5
Khối lượng rơm trước thủy phân
(g)
Khối lượng rơm sau thủy phân
(g)
Hiệu suất quá trình thủy phân rơm
(%)
NT 3 1,000 0,7893 21,07 ± 0,41
NT 4 1,000 0,7727 22,73 ± 0,36
NT3: Không bổ sung Tween 80; 0,1% NT4: Bổ sung Tween 80; 0,1%
Trong nghiên cứu này, hiệu suất thủy phân rơm thu được từ thí nghiệm có bổ sung Tween-80, 0,1% là cao hơn so với thí nghiệm không bổ sung Tween-80, 0,1%. Điều này cũng phù hợp những kết quả nghiên cứu của các tác giả Castanon, M (1981) và Fatma, H (2010) về hoạt động của chất hoạt động bề mặt trong quá trình thủy phân.
3.6. Thủy phân rơm trong bình lên men với các điều kiện thời gian, mật độ bào tử mốc, pH, chất hoạt động bề mặt đã chọn ở các thí nghiệm trên
Sinh khối lignocellulosic có thể được sử dụng để sản xuất ethanol, một nguồn năng lượng thay thế đầy hứa hẹn đối với dầu thô hạn chế hiện nay. Có hai quá trình chủ yếu tham gia vào chuyển đổi lignocellulosic đó là quá trình thủy phân cellulose để sản xuất đường khử và sự lên men của đường để sản xuất ethanol.
đối cao dựa trên công nghệ hiện tại. Những thách thức chính là năng suất thấp, chi phí cao của quá trình thủy phân. Hiện nay, có nhiều nỗ lực nghiên cứu đáng kể đã được thực hiện để cải thiện quá thủy phân của các vật liệu lignocellulosic.
Trong nghiên cứu này, với 5 gam rơm đã chuẩn bị cho vào 500 ml môi trường Mandle chứa trong bình lên men, duy trì pH ở mức 4,5 bằng dung dịch đệm Natri-acetate 0,1 M, pH 4,5. Sau đó, mang đi hấp khử trùng ở 1210C, trong thời gian 15 phút. Bào tử nấm mốc từ ống nghiệm được chuyển vào lọ thủy tinh có chứa Tween-80, 0,1% đã hấp khử trùng, mật độ bào tử bổ sung được sử dụng là 107 tế bào/ml. Bổ sung dịch bào tử mốc vào hỗn hợp rơm sau khi hấp khử trùng để nguội theo tỉ lệ 10% (v/v). Đặt bình lên men trên máy khuấy từ ở điều kiện nhiệt độ phòng. Tiến hành xác định hàm lượng đường khử, hoạt tính enzyme cellulase và xylanase trong thời gian thủy phân 5 ngày.
3.6.1. Hàm lượng đường khử
Trong nghiên cứu này, rơm được thủy phân bằng hệ enzyme được tạo ra từ nấm mốc Trichoderma reesei. Việc chuyển đường từ lignocellulosic này dựa vào enzyme cellulase và xylanase do nấm mốc tạo ra. Điều kiện thí nghiệm này được chọn theo báo cáo của (Patel.S.J et al., 2007). Thí nghiệm được bố trí như mô tả ở mục 2.2.6, điều chỉnh pH môi trường bằng dung dịch đệm Na- acetate 0,1M, pH 4,5, thu được kết quả hàm lượng đường khử được tạo ra theo thời gian 5 ngày như bảng 3.18
Bảng 3.18: Hàm lượng đường khử sau 5 ngày của 5 gam rơm Mật độ bào tử mốc
(bào tử/ml) Hàm lượng đường khử (mg/g rơm)
107 21,9 ± 0,12
3.6.2. Hoạt tính cellulase và xylanse
Cùng với việc theo dõi hàm lượng đường khử được tạo ra, tiến hành xác định hoạt tính của enzyme cellulase và xylanse. Kết quả xác định hoạt tính enzym cellulase và xylanse được trình bày ở bảng 3.19
Bảng 3.19: Hoạt tính enzym cellulase và xylanase sau 5 ngày Hoạt tính cellulase (IU/ml) Hoạt tính xylanase (IU/ml)
0,91 ± 0,01 3,48 ± 0,02
3.7. Lên men ethanol trong điều kiện cung cấp oxi với hai mức độ khác nhau với chủng Saccharomyces cerevisiae và Pichia stipitis
Trong nghiên cứu này, dịch thủy phân sau thời gian thủy phân rơm 5 ngày với nấm mốc Trichoderma reesei VTT-D-8013, dịch thủy phân được lọc và ly tâm với vận tốc 5000 vòng/phút trong thời gian 10 phút. Sau đó, xác định hàm lượng đường khử trong dịch thủy phân bằng phương pháp DNS. Kết quả đo được hàm lượng đường khử là 21,9 ± 0,12 mg/g nguyên liệu rơm. Nồng độ glucose trong dịch thủy phân dùng để lên men là 0,1 g/l.
Sử dụng 50 ml glucose 6% và 50 ml dịch thủy phân có hoặc không có bổ sung peptone và dịch chiết nấm men, cho lên men lần lượt với hai chủng
Saccharomyces cerevisiae và Pichia stipitis trong thời gian 4 ngày và lắc trên máy lắc với hai vận tốc khác nhau, ở điều kiện nhiệt độ phòng. Trong số các nghiệm thức được bố trí, sau thời gian 4 ngày thu dịch lên men và xác định hàm lượng ethanol bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp, có 4 nghiệm thức cho kết quả của quá trình lên men sinh ethanol đó là nghiệm thức 1, nghiệm thức 4, nghiệm thức 5, nghiệm thức 6 với kết quả như sau:
Theo bảng 3.25 đối với glucose 6% thì ở nghiệm thức 1 cho kết quả hàm lượng ethanol 5,07 g/l cao hơn nghiệm thức 6 cho kết quả hàm lượng ethanol 4,64 g/l. Theo Peiris (1987) đường khử được tạo ra bởi enzyme thủy phân rơm chủ yếu là glucose, xylose và cellobiose. Sản lượng ethanol được tạo ra từ lượng đường khử 4,8% (w/v) của dịch thủy phân rơm bởi nấm men
Saccharomyces cerevisiae 0.6% (w/v) là 10,7 g/1 ethanol và sản lượng ethanol được tạo ra là 18,8 g/1 từ 4,8% (w/v) glucose tinh khiết [29].
Thí nghiệm sử dụng dịch thủy phân có bổ sung pepton và dịch chiết nấm men lên men với giống Pichia stipitis và Sacharomyces cerevisiae với vận tốc
lắc 100 vòng/phút. Kết quả thu được hàm lượng ethanol từ việc lên men dịch thủy phân với giống Pichia stipitis là 40 mg/l và giống Sacharomyces cerevisiae là 69 mg/l. Kết quả này cho thấy tốc độ lắc tương ứng với việc cung cấp oxi khác nhau cũng ảnh hưởng đến khả năng tạo ethanol. Hàm lượng ethanol ở nghiệm thức 4 và 5 thấp hơn nghiệm thức 1 và 6 là do hàm lượng đường trong dịch thủy phân ban đầu thấp 21,9 ± 0,12 mg/g nguyên liệu rơm.
Bảng 3.20: Kết quả nồng độ ethanol NT Thành phần dịch thủy phân Thời gian lưu (h) Diện tích peak Nông độ (g/l)
1 ** Glucose (6%) + Saccharomyces cerevisiae 17,696 1705005 5,07
2 ** Dịch thủy phân + Saccharomyces cerevisiae - - -
3 ** Dịch thủy phân + Pichia stipitis - - -
4 ** Dịch thủy phân Dịch chiết nấm men Pepton 17,129 232032 0,69