Tốc độ tổng hợp enzyme phụ thuộc vào cơ chất dùng cho thủy phân. Một loạt các nguồn carbohydrate khác nhau đã được nghiên cứu cho sự tăng trưởng của Trichoderma reesei QM9414 và cảm ứng xylanase. Nhìn chung, lactose là một nguồn cacbon thông thường và cảm ứng sản xuất enzyme công nghiệp (đặc biệt là cellulase) đối với nấm Trichoderma reesei [41].
1.7.2.2. Nguồn nitơ
Nguồn nitơ trong nuôi cấy nấm Trichoderma reesei là ammonium sulphate hoặc dung dịch ammonia. Nitrate hoặc urea không thích hợp cho nuôi cấy T. reesei, peptone và dịch chiết nấm men có thể làm tăng việc sản xuất enzyme. Ở điều kiện nuôi cấy lắc, 30 g/l lactose and 5 g/l ammonium sulphate là sự lựa chọn tốt. Tỉ lệ C:N (w/w) ban đầu là 4:1 (4gram lactose/1 gram ammonium sulphate) [41].
1.7.2.3. Chất hoạt động bề mặt
Việc phân loại các chất hoạt động bề mặt dựa trên khả năng hòa tan trong nước và được chia thành các loại như sau: chất hoạt động bề mặt có bản chất là Anionic, Nonionic và Cationic [37].
Tween 80 (tên thương mại) là một chất hoạt động bề mặt thuộc nhóm nonionic, có tên gọi là Polyoxyethylene sorbitan monooleate hoặc Sorbitan monooleate ethoxylate. Độ hòa tan trong nước là 5-10 g/100 ml ở 23 ºC
Hình 1.8. Công thức cấu tạo Tween 80
Bên cạnh nguồn cacbon và nitơ còn có một vài yếu tố khác xem là điều kiện tối ưu cho nuôi cấy. Tween-80 là một chất hỗ trợ cho việc tiết enzyme với nồng độ tối ưu là 0,2 ml/l, ở nồng độ cao hơn sẽ không có lợi cho sản xuất enzyme cellulases [41].
Nghiên cứu sự ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt đối với hoạt động của enzyme xylanase và cellulase. Một loạt các chất hoạt động bề mặt được sử dụng, bao gồm các nhóm chất có bản chất là anionic, cationic, và nonionic. Kết quả cho thấy các hoạt động của các enzyme đã tăng với nhóm chất hoạt động bề mặt có bản chất là cationic và nonionic. Kết quả cho thấy hiệu quả sự dụng
enzyme xylanase và cellulase enzyme tăng khi sử dụng kết hợp với nhóm chất hoạt động bề mặt có bản chất là nonionic trong các quy trình trong công nghiệp giấy và bột giấy. Việc sử dụng nhóm chất hoạt động bề mặt có bản chất là cation được ưa chuộng hơn nhóm chất hoạt động bề mặt có bản chất là anion [24].
Chất hoạt động bề mặt có bản chất là nonionic, Tween 80, tăng tốc độ và mức độ đường hóa cellulose. Các cơ chế thủy phân bằng enzym có sự hiện diện của chất hoạt động bề mặt, các chất này cản trở sự cố định của các enzyme trên bề mặt cơ chất bằng cách giảm lực liên kết. Vì vậy, các enzyme có thể dễ dàng biến đổi và di chuyển đến các vi trí khác của cơ chất [24].
Các nghiên cứu của Ooshima và cộng sự, cho thấy chất hoạt động bề mặt có bản chất là nonionic, lưỡng tính và cationic tăng cường hoạt tính của enzyme cellulases trong khi chất hoạt động bề mặt có bản chất là anion thì không làm tăng hoạt tính của enzyme cellulase. Tuy nhiên, chất hoạt động bề mặt có bản chất cationic và anionic ở nồng độ tương đối thấp làm biến tính cellulase [24].
1.7.2.4. pH và nhiệt độ
pH là một trong những giá trị quan trọng trong việc sản xuất enzyme bởi
T. reesei (Denison, 2000). pH (7.0) là là phù hợp cho việc sản xuất enzyme xylanase từ T. reesei Rut C-30 trên môi trường tăng trưởng cơ bản là cellulose và xylan. Trong khi đó, để sản xuất tốt enzyme cellulase thì cần pH thấp là 4,0.
Nhiệt độ nuôi cấy không những ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng của vi sinh vật mà còn ảnh hưởng đến mức độ sản xuất enzyme xylanase. Trichoderma reesei Rut C-30 tăng trưởng tốt ở nhiệt độ từ 17, 28 và 37oC khi nuôi cấy trên nguồn cơ chất là lactose, tuy nhiên, ở nhiệt độ cao thì việc sản xuất xylanase tốt hơn, nhưng trái lại việc sản xuất enzyme cellulase thì giảm [41].
1.7.2.5. Sục khí
Khi sử dụng bình lên men để nuôi cấy nấm cho việc sản xuất enzyme, vận tốc lắc và mức độ cung cấp khí ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của nấm và sự tiết enzyme. Vận tốc lắc quá mạnh sẽ ảnh hưởng đến việc sản xuất enzyme xylanase. Sản xuất enzyme bởi T. reesei QM 9414 cần một vận lắc nghiêm ngặt. Khi sử dụng lactose làm cơ chất trong 15 lít dịch lên men, vận tốc lắc tối ưu là 200
vòng/phút. Hoạt tính xylanase thấp khi tốc độ lắc 130 vòng/phút, và với vận tốc lắc 400 vòng/phút hầu hết xylanase không được sản xuất. Ảnh hưởng của việc cung cấp oxygen trong nghiên cứu trên giống T. reesei Rut C-30 tăng trưởng 1 % cellulose hoặc xylan [41].
1.7.2.6. Lên men bán rắn
Bên cạnh việc lên men chìm, lên men bán rắn là một phương pháp phổ biến để sản xuất enzyme xylanase và cellulase từ nấm. Nấm sợi là loại tăng trưởng trên môi trường cơ chất rắn, như gỗ, hạt, thân, rễ và lá thực vật. So sánh giữa lên men chìm và lên men bán rắn thì lên men bán rắn có nhiều thuận lợi như sản phẩm lên men cao, sản phẩm cuối cao, tính ổn định của sản phẩm cao. Tuy nhiên, lên men bán rắn hiện tại chỉ dùng cho việc sản xuất enzyme qui mô nhỏ vì có một số vấn đề về kỹ thuật [41].
1.8. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân rơm rạ bởi enzyme cellulase và xylanase từ nấm mốc Trichoderma reesei
1.8.1. Ảnh hưởng của cấu trúc nguyên liệu
Sự ức chế enzyme do sản phẩm, sự giảm của các phần cơ chất dễ thủy phân, enzyme bị bất hoạt hoặc bị giữ lại trong các lỗ xốp của cellulose sẽ làm giảm tốc độ phản ứng thủy phân. Hiệu suất quá trình thủy phân bị ảnh hưởng mạnh bởi tính chất của nguồn nguyên liệu.
Khả năng tiếp cận vật liệu lignocellulosic của cellulase đóng vai trò quan trọng trong quá trình thủy phân. Cellulose có bề mặt ngoài bao gồm bề mặt bao quanh xơ sợi, bề mặt trong là bề mặt do các mao quản bên trong xơ sợi tạo thành. Hàm lượng và sự phân bố của lignin trong cấu trúc vật liệu có ảnh hưởng tới khả năng thủy phân của vật liệu đó. Hiệu suất thủy phân thu được khá cao đối với các nguyên lịêu đó được loại bỏ gần hết lignin.
1.8.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Giống như nhiều phản ứng enzyme khác, phản ứng thủy phân cellulose bằng enzyme cellulase chịu ảnh hưởng lớn của nhiệt độ. Tốc độ phản ứng thủy phân tăng theo nhiệt độ, tuy nhiên đến một nhiệt độ nhất định, tốc độ phản ứng sẽ
giảm dần và đến mức triệt tiêu. Phần lớn enzyme hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ 40 – 50oC. Riêng đối với enzyme cellulase, nhiệt độ tối ưu là 50oC. Nếu đưa nhiệt độ cao hơn nhiệt độ tối ưu hoạt tính enzyme sẽ bị giảm, khi đó enzyme không có khả năng phục hồi hoạt tính. Ngược lại khi ở nhiệt độ 0oC, enzyme bị hạn chế hoạt động rất mạnh, nhưng khi đưa nhiệt độ lên từ từ, hoạt tính của enzyme sẽ tăng dần đều đến mức tối ưu.
1.8.3. Ảnh hưởng của pH
pH môi trường thường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền của enzyme. Nhiều enzyme hoạt động rất mạnh ở pH trung tính. Tuy nhiên cũng có nhiều enzyme hoạt động ở môi trường acid yếu. Một số enzyme khác lại hoạt động mạnh ở pH kiềm và cả pH acid. Đối với enzyme cellulase, khoảng pH thích hợp là 4 - 5, trong đó tốt nhất là 4,8. Enzyme cellulase chỉ hoạt động tốt ở dãy pH 3,5 – 6,5 [13].
1.8.4. Tương tác giữa cơ chất và enzyme (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cellulase thường chứa liên kết carbohydrate để tạo điều kiện cho sự tương tác giữa enzyme và bề mặt cơ chất. Tương tự như các lĩnh vực xúc tác của hydrolases glycosyl, CBMs được chia thành các họ dựa trên cấu trúc tinh thể và cấu trúc tương đồng của acid amin. Sự khác biệt tinh tế trong cấu trúc của CBMs dẫn đến những ligand riêng. Thông qua liên kết với bề mặt của cellulose tinh thể, CBMs xúc tác với chất cụ thể và tăng cường hiệu quả xúc tác bằng cách tăng hiệu quả tập trung ở bề mặt. Ngoài mục tiêu, CBMs thực sự có thể có khả năng phá vỡ cấu trúc của polysaccharides, qua đó nâng cao tốc độ thủy phân [18].
1.8.5. Ảnh hưởng của các chất kiềm hãm
Hoạt động của enzyme cellulase, người ta nhận thấy, sản phẩm của phản ứng thủy phân, bao gồm cả cellobiose và glucose đều có tác động kìm hãm hoạt tính của cellulase, đặc biệt là cellobiose [44].
1.9. Chuyển hóa sinh học từ cellulose thành ethanol
Tiền xử lý sinh học để loại bỏ lignin hoặc hemixenluloza từ thành tế bào thực vật. So với các quá trình vật lý, hóa học, thì sinh học xử lý sơ bộ bao gồm
các phản ứng phức tạp hơn và tốn nhiều thời gian hơn, tuy nhiên, sẽ ít tốn chi phí về việc đầu tư các trang thiết bị.
1.9.1. Vi sinh vật phân hủy
Trong tiền xử lý sinh học, vi sinh vật, chủ yếu là nấm, được sử dụng để phân hủy lignin và hemicellulose trong các vật liệu phế thải. Pleurotus ostreatus và Pycnoporus cinnabarinus được dùng cho tiền xử lý sinh học vì hiệu quả cao làm giảm hoặc thay đổi hàm lượng lignin trong sinh khối chứa lignocellulosic [37]. Bên cạnh đó, một số cải tiến đã được thực hiện để trồng nấm nhằm cải thiện sự phân hủy của lignin và tránh sự suy giảm của cellulose. Ví dụ, tạo các đột biến nấm với khả năng sản xuất cellulase yếu hơn đã được thử nghiệm sẽ được áp dụng; hạn chế sự sẵn có của một số chất dinh dưỡng cần thiết cho sự trao đổi chất bình thường của nấm cũng là một cách tiếp cận hiệu quả dẫn đến việc sản xuất các enzyme phân hủy lignolytic hữu ích trong lignin.
1.9.2. Lên men ethanol
Quá trình lên men ethanol là quá trình lên men bắt đầu với con đường đường phân và còn gọi là EMP (Embden-Meyerhoff-Parnas). EMP là phản ứng phổ biến nhất cho phản ứng oxy hóa glucose để tạo thành pyruvate mà là một chất chuyển hóa trung gian quan trọng đối với hầu hết các sinh vật sống. Con đường EMP gồm có ba giai đoạn, cụ thể là: hoạt hóa của glucose; bẻ mạch hexose và phóng thích năng lượng. Các công thức phản ứng tổng quát cho quá trình EMP được tóm tắt trong phương trình
2 ATP + glucose + 4 ADP + 2Pi + 2 NAD+ →
2 ADP + 2 pyruvate + 4 ATP + 2 NADH + 2 H+
Ethanol được tạo ra như là sản phẩm cuối của con đường EMP. Trước tiên, acetaldehyde được sản xuất từ pyruvate bằng cách khử một phân tử CO2 của pyruvate, và sau đó acetaldehyde được chuyển thành ethanol theo phản ứng oxi hóa khử giữa NADH và NAD +. Ngoài ethanol, acid lactic cũng là một sản phẩm cuối của quá trình lên men vi sinh vật [41].
1.10. Chuyển hóa sinh học từ xylose thành ethanol và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men ethanol
Lên men đường xylose tạo thành ethanol được báo cáo lần đầu tiên vào năm 1959. Đến năm 1976, phát hiện ra chủng nấm men có khả năng đồng hóa xylose nhưng không có khả năng lên men xylose. Năm 1960, lần đầu tiên phát hiện ra sự chuyển hóa xylose thành xylulose và đến những năm 1980, mới phát hiện nấm men có khả năng lên men xylose thành ethanol [11].
Xylose đầu tiên được chuyển qua màng và sau đó được chuyển thành xylulose 5-P. Nhiều xylose được vẫn chuyển qua kênh proton với điều kiện pH cao ở một số loài vi khuẩn và nấm men, và được tóm tắt ở bảng 1.3
Bảng 1.3: Con đường vận chuyển xylose ở một vài loài vi khuẩn và nấm men [11]
Kênh vận chuyển Giống
Kênh proton Escherichia coli, Staphylococcus xylosus
Pichia stipitis
Thẩm thấu qua màng Saccharomyces cerevisiae
Kênh proton hiếu khí Rhodotorula sp.
Kênh proton và thẩm thấu qua màng Candida shehatae
Con đường chuyển hóa xylose thành xylulose được biểu diễn ở hình 1.10 Bước đầu tiên xylose được chuyển hóa thành xylitol bằng enzyme xylose reductase (XR). Xylitol được tiết ra khỏi tế bào hoặc bị oxi hóa bởi xylitol dehydrogenase (XDH). Các nghiên cứu của Bruinenberg và cộng sự chỉ ra rằng các enzyme tham gia vào việc đồng hóa xylose ở những nấm men khác nhau có đặc điểm riêng khác nhau đối với các đồng yếu tố như NADPH, NADH, NAD +
và NADP +. Pichia stipitis phản ứng đầu tiên có thể sử dụng NADPH hoặc NADH. Như vậy, NAD + được tạo ra và xylitol tích lũy không mạnh như với nấm men khác trong điều kiện yếm khí [11].
Hình 1.9: Lên men ethanol từ xylose [11]
D-xylose được chuyển thành D-xylulose bởi enzyme isomerase (ở vi khuẩn) hoặc oxi hóa khử (như trong nấm men và nấm mốc), quá trình chuyển hóa bằng phản ứng phosphoryl hóa. Phản ứng này được xúc tác bởi xylulokinase, chuyển xylulose thành 5-P-xylulose. 5-p-xylulose theo con đường pentose phosphate tiếp tục chuyển hóa thành glyceraldehyde-3-P, glyceraldehyde-3-P tiếp tục theo con đường trung gian glycolytic và chuyển thành pyruvat tham gia vào quá trình chuyển hóa thành ethanol. Những chất trung gian được chuyển đổi thành pyruvate trong Parnas Meyerhof embden (EMP) hoặc con đường Doudoroff Entner (ED), và pyruvate được chuyển thành acetaldehyde của pyruvate decarboxylase, đó là tiếp tục giảm xuống ethanol bởi dehydrogenase rượu [10].
Phương trình phản ứng hóa học
3 C5H10O5 5 C2H5OH + 5 CO2
Theo lý thuyết thì 1,67 mol ethanol/1 mol xylose và 2,0 mol ethanol/ 1mol glucose, trên cơ sở khối lượng thì 0,51 g ethanol/g xylose [11]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sản phẩm tạo ra thấp từ 0,3 - 0,9 g/l/h, đặc biệt là sự hiện diện của oxygen từ 0,1 - 0,2 g/l/h. Giảm sản lượng thu được chủ yếu là do sự tăng trưởng và xylitol tích lũy, mà có lẽ là kết quả của sự ức chế của NADH dehydrogenase xylitol dư thừa trong trường hợp không có đủ hô hấp. Quá trình lên men xylose của nấm men phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Sục khí là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất. Nhiều nhà nghiên cứu đã báo cáo rằng nấm men lên men xylose, yêu cầu oxy cho quá trình lên men xylose. Trong điều kiện yếm khí, ethanol rất thấp hoặc không được sản xuất. Pichia stipitis chỉ cho sản lượng ethanol cao trong điều kiện vi hiếu khí [11].
Việc nghiên cứu các chủng nấm men tự nhiên mà có thể chuyển đổi hexoses và pentoses để sản xuất ethanol, các nhà nghiên cứu đang cố gắng tối ưu hóa các điều kiện cho sự tăng trưởng tế bào và quá trình lên men, bao gồm các thành phần thủy phân, pH và nồng độ acetate. Các nghiên cứu tập trung vào khả năng lên men của các chủng Candida shehatae và Pichia stipitis về thủy phân gỗ với một hỗn hợp 01:01 của glucose và xylose. Kết quả thu được, tỷ lệ tối ưu sản xuất ethanol đã thu được với một phạm vi pH giữa 5,5 và 6,0, và một sản lượng ethanol của 0,41-0,46 g/g glucose và xylose có thể đạt được trong những thí nghiệm tối ưu [11].
1.11. Kết quả nghiên cứu ngoài nước
Năm 1998, tác giả Chadrakant và cộng sự báo cáo có ba phương pháp sản xuất ethanol từ cellulose:
Phương pháp thủy giải và lên men riêng lẻ (Separate Hydrolysis and Fermentation- SHF) là quá trình mà cellulose được thủy giải bằng enzyme cellulase tạo thành glucose ở bước đầu tiên và glucose được lên men tạo thành ethanol bằng cách sử dụng Saccharomyces hoặc Zymomonas trong bước thứ hai. Thuận lợi của phương pháp này là thực hiện từng bước với từng điều kiện nhiệt
độ tối ưu, là từ 450C đến 500C, hoặc 300C riêng biệt. Khó khăn chủ yếu của quá trình là đường được tạo ra từ sự thủy giải ức chế hoạt động của cellulase trong suốt quá trình thủy giải [11].
Phương pháp chuyển hóa trực tiếp bằng vi sinh vật (Direct Microbial Conversion- DMC) gồm ba quá trình đó là sinh cellulase, thủy giải celluolose và lên men đường trong cùng một bước. Vi sinh vật tham gia vào quá trình này là
Clostridium thermocellum. Bất lợi của phương pháp này là khả năng chịu đựng
ethanol thấp. Những nghiên cứu gần đây cho thấy khả năng chịu đựng ethanol khoảng 3,5%, ít hơn nhiều so với khả năng chịu đựng của nấm men tạo ethanol (khoảng 10%) và cũng có một phần đáng kể cacbon chuyển hóa tạo thành các sản