Quá trình lên men ethanol là quá trình lên men bắt đầu với con đường đường phân và còn gọi là EMP (Embden-Meyerhoff-Parnas). EMP là phản ứng phổ biến nhất cho phản ứng oxy hóa glucose để tạo thành pyruvate mà là một chất chuyển hóa trung gian quan trọng đối với hầu hết các sinh vật sống. Con đường EMP gồm có ba giai đoạn, cụ thể là: hoạt hóa của glucose; bẻ mạch hexose và phóng thích năng lượng. Các công thức phản ứng tổng quát cho quá trình EMP được tóm tắt trong phương trình
2 ATP + glucose + 4 ADP + 2Pi + 2 NAD+ →
2 ADP + 2 pyruvate + 4 ATP + 2 NADH + 2 H+
Ethanol được tạo ra như là sản phẩm cuối của con đường EMP. Trước tiên, acetaldehyde được sản xuất từ pyruvate bằng cách khử một phân tử CO2 của pyruvate, và sau đó acetaldehyde được chuyển thành ethanol theo phản ứng oxi hóa khử giữa NADH và NAD +. Ngoài ethanol, acid lactic cũng là một sản phẩm cuối của quá trình lên men vi sinh vật [41].
1.10. Chuyển hóa sinh học từ xylose thành ethanol và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men ethanol
Lên men đường xylose tạo thành ethanol được báo cáo lần đầu tiên vào năm 1959. Đến năm 1976, phát hiện ra chủng nấm men có khả năng đồng hóa xylose nhưng không có khả năng lên men xylose. Năm 1960, lần đầu tiên phát hiện ra sự chuyển hóa xylose thành xylulose và đến những năm 1980, mới phát hiện nấm men có khả năng lên men xylose thành ethanol [11].
Xylose đầu tiên được chuyển qua màng và sau đó được chuyển thành xylulose 5-P. Nhiều xylose được vẫn chuyển qua kênh proton với điều kiện pH cao ở một số loài vi khuẩn và nấm men, và được tóm tắt ở bảng 1.3
Bảng 1.3: Con đường vận chuyển xylose ở một vài loài vi khuẩn và nấm men [11]
Kênh vận chuyển Giống
Kênh proton Escherichia coli, Staphylococcus xylosus
Pichia stipitis
Thẩm thấu qua màng Saccharomyces cerevisiae
Kênh proton hiếu khí Rhodotorula sp.
Kênh proton và thẩm thấu qua màng Candida shehatae
Con đường chuyển hóa xylose thành xylulose được biểu diễn ở hình 1.10 Bước đầu tiên xylose được chuyển hóa thành xylitol bằng enzyme xylose reductase (XR). Xylitol được tiết ra khỏi tế bào hoặc bị oxi hóa bởi xylitol dehydrogenase (XDH). Các nghiên cứu của Bruinenberg và cộng sự chỉ ra rằng các enzyme tham gia vào việc đồng hóa xylose ở những nấm men khác nhau có đặc điểm riêng khác nhau đối với các đồng yếu tố như NADPH, NADH, NAD +
và NADP +. Pichia stipitis phản ứng đầu tiên có thể sử dụng NADPH hoặc NADH. Như vậy, NAD + được tạo ra và xylitol tích lũy không mạnh như với nấm men khác trong điều kiện yếm khí [11].
Hình 1.9: Lên men ethanol từ xylose [11]
D-xylose được chuyển thành D-xylulose bởi enzyme isomerase (ở vi khuẩn) hoặc oxi hóa khử (như trong nấm men và nấm mốc), quá trình chuyển hóa bằng phản ứng phosphoryl hóa. Phản ứng này được xúc tác bởi xylulokinase, chuyển xylulose thành 5-P-xylulose. 5-p-xylulose theo con đường pentose phosphate tiếp tục chuyển hóa thành glyceraldehyde-3-P, glyceraldehyde-3-P tiếp tục theo con đường trung gian glycolytic và chuyển thành pyruvat tham gia vào quá trình chuyển hóa thành ethanol. Những chất trung gian được chuyển đổi thành pyruvate trong Parnas Meyerhof embden (EMP) hoặc con đường Doudoroff Entner (ED), và pyruvate được chuyển thành acetaldehyde của pyruvate decarboxylase, đó là tiếp tục giảm xuống ethanol bởi dehydrogenase rượu [10].
Phương trình phản ứng hóa học
3 C5H10O5 5 C2H5OH + 5 CO2
Theo lý thuyết thì 1,67 mol ethanol/1 mol xylose và 2,0 mol ethanol/ 1mol glucose, trên cơ sở khối lượng thì 0,51 g ethanol/g xylose [11].
Sản phẩm tạo ra thấp từ 0,3 - 0,9 g/l/h, đặc biệt là sự hiện diện của oxygen từ 0,1 - 0,2 g/l/h. Giảm sản lượng thu được chủ yếu là do sự tăng trưởng và xylitol tích lũy, mà có lẽ là kết quả của sự ức chế của NADH dehydrogenase xylitol dư thừa trong trường hợp không có đủ hô hấp. Quá trình lên men xylose của nấm men phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Sục khí là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất. Nhiều nhà nghiên cứu đã báo cáo rằng nấm men lên men xylose, yêu cầu oxy cho quá trình lên men xylose. Trong điều kiện yếm khí, ethanol rất thấp hoặc không được sản xuất. Pichia stipitis chỉ cho sản lượng ethanol cao trong điều kiện vi hiếu khí [11].
Việc nghiên cứu các chủng nấm men tự nhiên mà có thể chuyển đổi hexoses và pentoses để sản xuất ethanol, các nhà nghiên cứu đang cố gắng tối ưu hóa các điều kiện cho sự tăng trưởng tế bào và quá trình lên men, bao gồm các thành phần thủy phân, pH và nồng độ acetate. Các nghiên cứu tập trung vào khả năng lên men của các chủng Candida shehatae và Pichia stipitis về thủy phân gỗ với một hỗn hợp 01:01 của glucose và xylose. Kết quả thu được, tỷ lệ tối ưu sản xuất ethanol đã thu được với một phạm vi pH giữa 5,5 và 6,0, và một sản lượng ethanol của 0,41-0,46 g/g glucose và xylose có thể đạt được trong những thí nghiệm tối ưu [11].
1.11. Kết quả nghiên cứu ngoài nước
Năm 1998, tác giả Chadrakant và cộng sự báo cáo có ba phương pháp sản xuất ethanol từ cellulose:
Phương pháp thủy giải và lên men riêng lẻ (Separate Hydrolysis and Fermentation- SHF) là quá trình mà cellulose được thủy giải bằng enzyme cellulase tạo thành glucose ở bước đầu tiên và glucose được lên men tạo thành ethanol bằng cách sử dụng Saccharomyces hoặc Zymomonas trong bước thứ hai. Thuận lợi của phương pháp này là thực hiện từng bước với từng điều kiện nhiệt
độ tối ưu, là từ 450C đến 500C, hoặc 300C riêng biệt. Khó khăn chủ yếu của quá trình là đường được tạo ra từ sự thủy giải ức chế hoạt động của cellulase trong suốt quá trình thủy giải [11].
Phương pháp chuyển hóa trực tiếp bằng vi sinh vật (Direct Microbial Conversion- DMC) gồm ba quá trình đó là sinh cellulase, thủy giải celluolose và lên men đường trong cùng một bước. Vi sinh vật tham gia vào quá trình này là
Clostridium thermocellum. Bất lợi của phương pháp này là khả năng chịu đựng
ethanol thấp. Những nghiên cứu gần đây cho thấy khả năng chịu đựng ethanol khoảng 3,5%, ít hơn nhiều so với khả năng chịu đựng của nấm men tạo ethanol (khoảng 10%) và cũng có một phần đáng kể cacbon chuyển hóa tạo thành các sản phẩm phụ như acid acetic và acid lactic [11].
Phương pháp thủy phân và lên men đồng thời (Simultaneous Saccharification and Fermentation-SSF). Trong quá trình này sự thủy phân cellulose để tạo thành glucose gồm enzyme cellulase và lên men đường để tạo ethanol bởi Saccharomyces hoặc Zymomonas. Một trong những yêu cầu quan trọng trong việc thực hiện thành công quá trình trên là khả năng tương thích của hệ thống thủy phân và lên men với các điều kiện nhiệt độ, pH và hàm lượng cơ chất. Trichoderma được sử dụng như một nguồn enzyme cellulase cho quá trình. Nhiệt độ tối ưu cho enzyme cellulase của nấm Trichoderma reesei là 45 - 500C, trong khi quá trình lên men với Saccharomyces cerevisiae là khoảng 300C. Bởi vì nhiệt độ tối ưu của chúng là không tương thích nên sự điều chỉnh giữa hai nhiệt độ là cần thực hiện. Những thuận lợi chính được đề cập trong quá trình này bao gồm: (1) tăng cường tốc độ thủy giải cellulose thành đường, (2) lượng enzyme nạp vào thấp, (3) sản lượng sản phẩm cao, (4) giảm sự ức chế của việc lên men của nấm men trong khi tạo ethanol và (5) tăng yêu cầu về điều kiện vô trùng. Dựa trên những cải tiến này, quá trình thủy phân và lên men đồng thời là một trong những lựa chọn kinh tế nhất để sản xuất ethanol từ sinh khối lignocellulosic [11].
chuyển hóa lignocellulosic thành ethanol có ba bước chính (1) tiền xử lý hóa học, (2) thủy phân bằng enzyme, (3) lên men đường bằng các chủng vi sinh vật đặc biệt cho kết quả tốt. Tuy nhiên, giá thành cao nên tác giả đề nghị sử dụng vi sinh vật có khả năng sử dụng nhiều loại đường [18].
Năm 2007, tác giả Patel và cộng sự báo cáo kết quả nghiên cứu về việc bước đầu nghiên cứu vấn đề tiền xử lý và lên men các phế phụ phẩm nông nghiệp như trấu gạo và bã mía. Sự kết hợp của năm chủng nấm khác nhau được dùng cho việc tiền xử lý và sử dụng Saccharomyces cerevisiae (NCIM 3095) cho quá trình lên men. Trấu gạo và bã mía được xử lý với Aspergillus awamori và Pleurotus sajor-caju cho sản lượng ethanol tốt (8,5g/l và 9,8g/l) [33].
Tiền xử lý bằng enzyme thủy giải từng bước chuyển hóa cellulose và hemicellulose, polysaccharides thành những đường có thể lên men được. Có vài sự lựa chọn bước thủy phân và lên men: (a) thủy phân và lên men riêng lẻ (SHF) emzyme thủy giải thêm vào trước khi lên men, (b) thủy phân và lên men đồng thời (SSF) enzyme được thêm vào cùng lúc với vi sinh vật, (c) đường hóa và lên men đồng thời, vi sinh vật sản xuất ra enzyme, một quá trình chuyển hóa trực tiếp lignocellulose bởi vi sinh vật (DMC). Mỗi một phương pháp lựa chọn đều có ưu và khuyết điểm, chất ức chế, sản lượng ethanol, ethanol tolerance, sản phẩm phụ khác nhau.
Tiền xử lý sinh khối lignocellulosic là bước đầu tiên để chuyển hóa sinh khối thành các phân tử có thể sử dụng được đòi hỏi năng lượng rất cao (hơi và điện), lò phản ứng chịu được sự ăn mòn và áp suất cao và nhiệt độ cao. Những điều kiện này không những làm gia tăng chi phí của quá trình mà còn làm tiêu hao lượng đường. Tiền xử lý bằng vi sinh vật được báo cáo là có thể kết hợp hai ưu điểm là chi phí thấp khắc phục những điều kiện nghiêm ngặt của phản ứng. Tám tác nhân sinh học, bao gồm nấm và vi khuẩn, được sử dụng trong việc tiền xử lý bã mía. Các loại nấm và vi khuẩn tham gia vào thí nghiệm chúng đã góp phần làm giảm tỉ lệ C:N từ 108:1 xuống còn khoảng 42:1 đến 60:1. Tỉ lệ C:N được chuyển hóa mạnh nhất là khoảng 61% đối với nấm Aspergillus terreus,
Cellulomonas uda (52%), Trichoderma reesei và Zymomonas mobilis (49%). Những tác nhân sinh học này phân hủy bã mía nhờ tạo ra enzyme cellullase. Lượng cellullase được tạo ra nhiều nhất ở Aspergillus terreus, C.uda,
Cellulomonas cartae và Bacillus macerans. Vi sinh vật tiền xử lý bả mía tạo thành các phân tử đường cho quá trình thủy giải mà sử dụng trực tiếp để sản xuất ethanol [21].
Sử dụng kỹ thuật thủy phân và lên men đồng thời (SSF) để sản xuất ethanol từ sinh khối lá và thân cây bắp. Ứng dụng kỹ thuật này cho việc tiền xử lý khoảng 0,5 grams sinh khối với ammonia ở áp suất và nhiệt độ phòng trong 24 giờ, sau đó lên men với Saccharomyces cerevisiae D5A trong vòng 24 giờ có sử dụng Spezyme CP, để thuỷ giải cấu trúc polysaccharides. Ethanol thu được sau 24 giờ được phân tích bằng HPLC. Sản lượng ethanol sinh ra tối đa là từ 44,9% đến 73% [21].
1.12. Kết quả nghiên cứu trong nước
Rơm rạ chiếm tỷ lệ lớn trong các phụ phẩm nông nghiệp Việt Nam. Với thành phần chứa hơn 40% là cellulose, rơm rạ là nguồn nguyên liệu thích hợp cho quá trình sản xuất ethanol. Với đề tài “Nghiên cứu sản xuất ethanol nhiên liệu từ rơm rạ” của tác giả Trần Diệu Lý [5] bằng cách sử dụng rơm rạ cắt nhỏ và được tiền xử lý bằng phương pháp nổ hơi để phá vỡ cấu trúc. Sau đó được tiến hành thủy phân bằng enzyme cellulase hoặc thủy phân và lên men đồng thời bằng enzyme cellulase và nấm men Saccharomyces cerevisiae chủng turbo yeast extra. Kết quả cho thấy rằng, quá trình thủy phân diễn ra tốt nhất trong điều kiện: 11% bã rắn, 5% enzyme, 500C và pH 4,8, tương ứng nồng độ glucose thu được là 55,08g/l và hiệu suất đạt 81%. Quá trình thủy phân và lên men đồng thời đạt được kết quả tốt ở 11% bã rắn, 5% enzyme, 23,6 triệu tế bào nấm men/ml, 500C và pH 4,8. Quá trình này thu được 30,86g/l ethanol tương ứng hiệu suất là 86,61%. Kết quả này cho thấy quá trình thủy phân và lên men đồng thời rất thích hợp cho việc sản xuất ethanol từ rơm rạ [5].
khác nhau và các phương pháp đều chưa khắc phục được mức đầu tư và các điều kiện nghiêm ngặt về thiết bị. Đề tài này nghiên cứu nhằm mục đích cải tiến điều kiện thiết bị, còn vấn đề mức đầu tư vẫn có chi phí cao, tuy nhiên, vì mục đích phát triển bền vững nên nguồn nhiên liệu sinh học khuyến khích sử dụng. Nên chúng tôi bước đầu nghiên cứu việc sử dụng tác nhân sinh học để xử lý sinh khối rơm thành các đường có thể tham gia vào quá trình lên men để sản xuất ethanol.
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu
2.1.1. Nguyên vật liệu2.1.1.1. Rơm 2.1.1.1. Rơm
Rơm sử dụng trong thí nghiệm được thu từ Huyện Củ Chi - Tp.Hồ Chí Minh. Rơm rửa sạch, phơi khô dưới ánh nắng tự nhiên và được cắt thành từng đoạn ngắn từ khoảng 1 - 2 cm, đem sấy ở nhiệt độ 1050C, sau khi sấy được xay nhuyễn thành kích thước từ 1 - 2 mm và có hàm lượng ẩm là 2%.
Hình 2.1. Nguyên liệu rơm được xử lý sơ bộ: (a) Rơm được cắt nhỏ 1 - 2 cm, (b) Rơm được xay nhuyễn 1 - 2 mm
2.1.1.2. Vi sinh vật
a. Nấm mốc Trichoderma reesei VTT-D-80133 từ Viện Sinh học Nhiệt Đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Nấm mốc Trichoderma reesei
VTT-D-80133 bảo quản đông khô và được hoạt hóa trong môi trường PDA lỏng, lắc ở nhiệt độ phòng trong thời gian 5 ngày. Sau đó, dùng que cấy vô trùng chuyển sang môi trường thạch nghiêng PDA và để ở nhiệt độ phòng trong thời gian 5 - 7 ngày đến khi sợi tơ nấm xuất hiện bào tử có màu xanh như hình 2.2. Khi bào tử được hình thành đem các ống giống mốc bảo quản ở 40C.
Hình 2.2. Nấm mốc Trichoderma reesei VTT-D-8013: (a) Nấm mốc đã xuất hiện bào tử (mặt trước), (b) Nấm mốc đã xuất hiện bào tử (mặt sau)
b. Nấm men Pichia Stipitis từ Viện Sinh học Nhiệt Đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Nấm men Pichia Stipitis được giữ trên môi trường thạch nghiêng YDP bảo quản ở 40C, được hoạt hóa trong môi trường YDP lỏng, lắc ở nhiệt độ phòng trong thời gian 2 ngày. Sau đó, bảo quản ở nhiệt độ 40C
c. Nấm men Saccharomyces cerevisiae từ Viện Sinh học Nhiệt Đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Nấm men Saccharomyces cerevisiae được giữ trên môi trường thạch nghiêng Hansen bảo quản ở 40C, được hoạt hóa trong môi trường Hansen lỏng, lắc ở nhiệt độ phòng trong thời gian 2 ngày. Sau đó, bảo quản ở nhiệt độ 40C
2.1.2. Hóa chất và môi trường2.1.2.1. Hóa chất 2.1.2.1. Hóa chất
a. Hóa chất và dịch chiết dùng trong nuôi cấy vi sinh vật
- Amonium sulphate (NH4)2SO4; Calcium Cloride CaCl2; Magnesium sulphate MgSO4.7H2O; Mangansium sulphate MnSO4.H2O; Potassium dihydrophosphate KH2PO4; Ure
- Glucose; dịch chiết khoai tây; dịch chiết nấm men; dịch chiết lúa mạch; pepton; trypton và agar.
b. Hóa chất, chất chuẩn, thuốc thử và cơ chất dùng trong phân tích
* Chất chuẩn: Glucose (Trung Quốc); Xylose (Merk); Enzym Cellulase và Xylanase (hãng Amano và Fluka).
* Hóa chất sử dụng để pha dung dịch đệm: Acid acetic CH3COOH; Natri acetate CH3COONa; Tween 20, CaCl2.
* Cơ chất: Xylan và CMC.
* Thuốc thử: 2-Hydroxy-3,5-dinitrobenzoic acid (Merk); Potassium sodium tartate tetrahydrate; Sodium hydroxit NaOH; KOH.
2.1.2.2. Môi trường hoạt hóa và nuôi cấy vi sinh vật
a. Thành phần môi trường PGA (g/l) hoạt hóa, nuôi cấy Trichoderma reesei VTT-D-80133
- Khoai tây : 200 g
- Glucose : 20 g
- Agar : 20 g
Thêm nước cất đủ 1000ml, pH 6,5 ± 0,1
b. Thành phần môi trường Hansen (g/l) hoạt hóa, nuôi cấy Saccharomyces cerevisae - Glucose : 50 g - Trypton : 10 g - KH2PO4 : 2 g - MgSO4.7H2O : 2 g Thêm nước cất đủ 1000 ml, pH 5,5 ± 0,1
c. Thành phần môi trường YDP (g/l) hoạt hóa và nuôi cấy nấm men Pichia stipitis - Glucose : 20 g - Yeast extract : 1,5 g - Peptone : 5 g - Malt extract : 2 g Thêm nước cất đủ 1000 ml, pH 5,0 ± 0,1
d. Thành phần môi trường Mandle (g/l) sử dụng trong thủy phân rơm - Urê : 0,3 g - (NH4)2SO4 : 0,3 g - KH2PO4 :1,4 g - CaCl2 : 2 g - MgSO4.7H2O : 0,3 g