Tương tự như thí nghiệm khảo sát yếu tố thời gian, tiến hành xác định hoạt tính enzym cellulase và xylanase, kết quả được trình bày ở bảng 3.6
Bảng 3.6: Hoạt tính enzym cellulase và xylanase Mật độ bào tử mốc (bào tử/ml) Hoạt tính enzyme cellulase (IU/ml) Hoạt tính enzyme xylanase (IU/ml) 106 0,15± 0,01 0,22± 0,04 107 0,27 ± 0,01 0,52 ± 0,01 108 0,20 ± 0,02 0,30± 0,04
Từ bảng 3.6 vẽ được biểu đồ biểu diễn hoạt tính enzyme cellulase và xylanase được tạo ra theo các kiểu mật độ bào tử mốc như sau
0.15 0.20 0.22 0.52 0.30 0.27 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 Mật độ bào tử mốc (bào tử/ml) H o ạ t tí n h e n z y m e c e ll u la s e v à x y la n a s e ( U I/ m l)
Họat tính enzyme cellulase (IU/ml) Hoạt tính enzyme xylanase (IU/ml)
Hình 3.6: Biểu đồ biểu diễn hoạt tính cellulase, xylanase theo mật độ bào tử mốc
106 107
Dựa vào kết quả bảng 3.6 và hình 3.6 ta nhận thấy hoạt tính enzyme cellulase được tạo ra ở thí nghiệm có bổ sung mật độ bào tử mốc là 107 có hoạt tính cao nhất (0,27± 0,01 IU/ml) và hoạt tính enzyme xylanse được tạo ra ở thí nghiệm có bổ sung mật độ bào tử mốc là 107 có hoạt tính cao nhất (0,52 ± 0,01 IU/ml). Kết quả hoạt tính của enzyme cellulase và xylanase trong thí nghiệm 3.2 tương đương với hoạt tính của enzyme cellulase và xylanase ở thí nghiệm 3.1 với cùng điều kiện thí nghiệm.
3.2.3. Hiệu suất của quá trình thủy phân rơm
Kết thúc quá trình thủy phân ta xác định khối lượng rơm sau khi thủy phân, từ đó tính được hiệu suất của quá trình thủy phân rơm theo các mức mật độ bào tử được bổ sung. Kết quả được ghi nhận theo bảng 3.7
Bảng 3.7: Hiệu suất của quá trình thủy phân rơm Mật độ bào tử mốc
(bào tử/ml)
Khối lượng rơm trước thủy phân
(g)
Khối lượng rơm sau thủy phân
(g)
Hiệu suất quá trình thủy phân rơm
(%)
106 1,000 0,8215 17,85± 0,03
107 1,000 0,8015 19,85± 0,04
108 1,000 0,8209 17,91± 0,09
Dựa vào kết quả của bảng 3.7 ta nhận thấy, hiệu suất quá trình thủy phân của thí nghiệm có mật độ bào tử mốc bổ sung 107 là cao nhất (19,85 ± 0,04 %) cao hơn hiệu suất thủy phân của các thí nghiệm còn lại.
3.3. Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố pH ban đầu đến hàm lượng đường khử trong quá trình thủy phân rơm
3.3.1. Hàm lượng đường khử
Mục tiêu của thí nghiệm là theo dõi ảnh hưởng của pH trong quá trình thủy phân rơm, để xác định pH tối ưu và thu được hàm lượng đường khử cao nhất. Thí nghiệm được bố trí như mô tả ở mục 2.3.3, điều chỉnh pH hỗn hợp
ban đầu bằng dung dịch đệm Na-acetate 0,1 M, pH = 4,5. Kết quả thu được hàm lượng đường khử tạo ra trong thời gian 5 ngày như bảng 3.8
Bảng 3.8: Hàm lượng đường khử tạo ra tương ứng với các giá trị pH ban đầu khác nhau trong quá trình thủy phân rơm
Hàm lượng đường khử (mg/g rơm) pH
4,0 4,5 5,0 5,5
10,98 ± 0.63 19,78 ± 0.63 7,11 ± 0.37 6,13 ± 0.32 Từ kết quả bảng 3.8 ta nhận thấy, hàm lượng đường khử tạo ra ở điều kiện pH 4,5 là cao hơn so với pH 4,0; 5,0 và 5,5. Hàm lượng đường khử được tạo ra ở pH 4,0; 5,0 và 5,5 là có sự khác biệt, nhưng hàm lượng đường khử tạo ra thấp. Điều này được giải thích như sau do pH dịch thủy phân được điều chỉnh ban đầu ở các mức là 4,0; 4,5; 5,0; 5,5 nhưng bắt đầu từ ngày thứ 3, pH của các thí nghiệm đã tăng lên 7.17, nên không thích hợp cho enzyme hoạt động. Ở pH 4,5 có hàm lượng đường khử được tạo ra là do giai đoạn đầu pH môi trường chưa tăng.
3.3.2. Hoạt tính enzyme cellulase
Hoạt tính enzym cellulase và xylanse cũng được xác định trong quá trình thủy phân rơm. Kết quả xác định hoạt tính enzym cellulase được trình bày ở bảng 3.9
Bảng 3.9: Hoạt tính enzym cellulase
Hoạt tính cellulase (IU/ml) pH
4,0 4,5 5,0 5,5
Kết quả ở bảng 3.9 cho thấy các hoạt tính enzym cellulase thí nghiệm có pH ban đầu 4,5 cao hơn ở các giá trị pH khác. Ở các giá trị pH khác enzym vẫn hoạt động nhưng hoạt tính giảm. Sự thay đổi hoạt tính cellulase ở các giá trị pH khảo sát có thể giải thích như sau: Mỗi enzym có khoảng pH hoạt động và điểm pH tối ưu đặc trưng. Protein enzym gồm nhiều amino acid, một số amino acid dễ bị phân cực như histidine, aspartic, glutamic, cysteine,…nên ở pH khác nhau điện tích của nó sẽ thay đổi. Sự thay đổi này có thể ảnh hưởng đến trung tâm hoạt động của enzym, ảnh hưởng đến sự gắn kết enzym và cơ chất. Do đó ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme.
Theo Fatma (2010), pH < 4,8 và pH > 4,8 là không phù hợp cho enzyme được sản xuất từ nấm mốc Trichoderma reesei, hoạt tính enzyme cellulase đạt 15,10 IU/g rơm ở pH tối ưu là 4,8 [16]. Theo kết quả từ bảng 3.9 mức pH của môi trường cho thấy giá trị pH tối ưu cho việc sản xuất enzyme cellulase được thu thập ở pH 4,5. pH tối ưu là rất quan trọng cho sự phát triển của các vi sinh vật và các hoạt động trao đổi chất của nó. Do các hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật rất nhạy cảm với thay đổi độ pH, cellulase sản xuất bởi Trichoderma reesei bị ảnh hưởng bởi sự thay đổi pH của môi trường. Cellulase từ
Trichoderma reesei làm việc tốt hơn trong môi trường axit (4,5-5,0) và sản xuất cellulase tối đa ở pH 4,5 [38].
3.3.3. Hoạt tính enzyme xylanase
Độ pH < 3,5 và pH > 6,5 không thích hợp cho enzyme được sản xuất từ nấm Trichoderma reesei. Dữ liệu minh họa rằng các enzyme có thể được hoạt động tối ưu ở pH 4,8. Xylanase sản xuất từ Trichoderma reesei rut C-30 đã được khảo sát tại các giá trị khác nhau ban đầu pH (4,8, 5,9 và 7,0) có bổ sung rơm trong điều kiện lắc trên máy lắc, và trong bình lên men, để xác định điều kiện pH tốt nhất. Theo nghiên cứu của Colina và cộng sự thì hoạt tính xylanase tối đa là 92 và 122 IU/ml, đạt ở pH 4,8 trong điều kiện lắc và trong bình lên men, trong đó sự phát triển tốt của nấm đã được quan sát trong 24 giờ đầu và sự tiêu thụ protein hòa tan từ rơm gây ra độ pH tăng lên đến giá trị từ 6,4 và 6,7 (tối ưu cho sản xuất xylanase) [12].
Bảng 3.10: Hoạt tính enzyme xylanse
Hoạt tính enzyme xylanse (IU/ml) pH
4,0 4,5 5,0 5,5
2,56± 0,02 2,59± 0,02 2,89± 0,11 3,79± 0,01 Hoạt tính xylanase tăng cao bắt đầu ở giá trị pH ban đầu là 5,0 và tiếp tục tăng ở giá trị pH là 5,5. Ở các giái trị pH khác xylanase vẫn hoạt động nhưng hoạt tính không cao. Sự thay đổi hoạt tính enzyme xylanase ở các giá trị pH khảo sát cũng có thể giải thích như sự thay đổi hoạt tính enzyme cellulase ở các giá trị pH khảo sát được trình bày
Theo Howard (2003), Trichoderma reesei sản xuất enzyme endo -1,4 - beta xylanase với hoạt tính riêng 6630 (μmol/min/mg) là tối ưu ở pH = 5 [20].
3.3.4. Hiệu suất của quá trình thủy phân rơm
Kết thúc quá trình thủy phân ta xác định khối lượng rơm sau khi thủy phân, từ đó tính được hiệu suất của quá trình thủy phân rơm ở các giá trị pH khác nhau. Kết quả được ghi nhận theo bảng 3.11
Bảng 3.11: Hiệu suất thủy phân rơm ở các điều kiện pH khác nhau
Hiệu suất thủy phân (%) pH
4,0 4,5 5,0 5,5
18,79± 0,04 19,79 ± 0,21 18,89± 0,11 18,53 ± 0,21 Từ các kết quả ghi nhận ở bảng 3.11 ta thấy hiệu suất thủy phân ở điều kiện pH = 4,5 là cao nhất so với các điều kiện pH = 4,0; 5,0 và 5,5
3.4. Khảo sát hàm lượng đường khử tạo rạ khi sử dụng và không sử dụng dung dịch đệm Na-acetate trong quá trình thủy phân rơm
3.4.1. Hàm lượng đường khử
Khảo sát ảnh hưởng của độ pH trong quá trình thủy phân giá trị pH tối ưu để enzyme hoạt động là pH 4,8. pH tối ưu rất quan trọng cho sự phát triển và hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật. Hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật rất nhạy cảm với sự thay đổi của pH, cellulase sản xuất bởi Trichoderma reesei bị ảnh hưởng bởi thay đổi pH của môi trường. Sản lượng đường tối ưu thu được ở pH 4,8. pH là một trong những yếu tố quan trọng nhất cho bất kỳ quá trình lên men mà phụ thuộc vào vi sinh vật vì mỗi vi sinh vật thích nghi một khoảng pH cho sự phát triển và hoạt động của nó. Tăng hoặc giảm giá trị pH tối ưu đều ảnh hưởng đến kết quả của sản phẩm lên men.
Từ kết quả thu được ở thí nghiệm 3.1 cho thấy pH dịch thủy phân bắt đầu tăng trên 7 ở ngày thứ 3, ở điều kiện pH > 7 không phù hợp cho enzyme hoạt động và ở thí nghiệm 3.3 cho kết quả về hàm lượng đường khử cao nhất khi điều chỉnh pH ban đầu là 4,5, nên tiến hành thí nghiệm với việc sử dụng dung dịch đệm Na-acetate 0,1 M, pH 4,5. Thí nghiệm được bố trí như mô tả ở mục 2.3.4, kết quả thu được hàm lượng đường khử được tạo ra theo mốc thời gian 5 ngày như bảng 3.12
Bảng 3.12: Hàm lượng đường khử tạo ra khi sử dụng và không sử dụng dung dịch đệm Na-acetate
Nghiệm thức Hàm lượng đường
khử (mg/g rơm)
Không dùng đệm Na-acetate, điều chỉnh pH ban đầu là 4,5 17,34 ± 0,58 Dùng dung dịch đệm Na-acetate 0,1M, pH = 4,5 20,35 ± 0,87
Từ kết quả bảng 3.12 ta thấy hàm lượng đường khử ở thí nghiệm dùng dung dịch đệm Na-acetate 0,1M, pH = 4,5 là cao hơn so với hàm lượng đường khử khi không sử dụng dung dịch đệm Na-acetate 0,1M, pH = 4,5.
3.4.2. Hoạt tính enzyme cellulase và xylanase
Hoạt tính enzym cellulase và xylanse cũng được xác định trong quá trình thủy phân rơm. Kết quả xác định hoạt tính enzym cellulase và xylanase được trình bày ở bảng 3.13
Bảng 3.13: Hoạt tính enzym cellulase và xylanase tạo ra khi sử dụng và không sử dụng dung dịch đệm Na-acetate
Nghiệm thức Hoạt tính cellulase (IU/ml) Hoạt tính xylanase (IU/ml) Không sử dụng dung dịch đệm
Na-acetate 0,1M, pH = 4,5 0,60 ± 0,01 2,68 ± 0,03
Sử dụng dung dịch đệm
Na-acetate 0,1M, pH = 4,5 0,84 ± 0,01 3,38 ± 0,08
Từ bảng 3.13 vẽ được biểu đồ biểu diễn hoạt tính enzyme cellulase và xylanase được tạo ra trong quá trình thủy phân rơm
2.68 0.60 3.38 0.84 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 Không sử dụng Sử dụng Dung dịch đệm Na-acetate 0,1M, pH = 4,5 H o ạt t ín h e n zy m e ce ll u la se và x yl an as e (I U /m l)
Hoạt tính cellulase (IU/ml) Hoạt tính xylanase (IU/ml)
Hình 3.7: Biểu đồ biểu diễn hoạt tính enzym cellulase và xylanase tạo ra khi sử dụng và không sử dụng dung dịch đệm Na-acetate
Qua các thí nghiệm trên ta thấy vai trò của dung dịch đệm Na-acetate 0,1M, pH = 4,5 góp phần làm ổn định giá trị pH, tạo điều kiện thuận lợi cho hoạt động của các enzyme trong quá trình thủy phân.
3.4.3. Hiệu suất phản ứng thủy phân rơm
Kết thúc quá trình thủy phân ta xác định khối lượng rơm sau khi thủy phân, từ đó tính được hiệu suất của quá trình thủy phân rơm. Kết quả được ghi nhận theo bảng 3.14
Bảng 3.14: Hiệu suất của quá trình thủy phân rơm
Nghiệm thức
pH = 4,5
Khối lượng rơm trước thủy phân
(g)
Khối lượng rơm sau thủy phân
(g)
Hiệu suất quá trình thủy phân rơm
(%)
NT 1 1,000 0,7900 21,00 ± 0,38
NT 2 1,000 0,8040 19,60 ± 0,28
NT1: Dùng dung dịch đệm Na-acetate 0,1M, pH = 4,5
NT2: Không dùng đệm Na-acetate, điều chỉnh pH ban đầu là 4,5
Trong nghiên cứu này, hiệu suất thủy phân rơm thu được từ thí nghiệm có dùng dung dịch đệm Na-acetate 0,1M, pH = 4,5 là cao hơn so với hiệu suất thủy phân khi không sử dụng dung dịch đệm Na-acetate 0,1M, pH = 4,5. Kết quả trên cho thấy vai trò của dung dịch đệm Na-acetate 0,1M, pH = 4,5 làm ổn định giá trị pH tạo điều kiện thuận lợi cho enzyme hoạt động.
3.5. Khảo sát ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt lên quá trình thủy phân rơm
3.5.1. Hàm lượng đường khử
Mục tiêu của thí nghiệm này là khảo sát ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt đến hàm lượng đường khử được tạo rạ trong quá trình thủy phân rơm. Từ thí nghiệm được bố trí ở mục 2.3.5, thu được kết quả hàm lượng đường khử theo bảng 3.15
Bảng 3.15: Hàm lượng đường khử tạo ra khi bổ sung và không bổ sung Tween- 80; 0,1%
Nghiệm thức Hàm lượng đường khử
(mg/g rơm)
Không bổ sung Tween-80; 0,1% 19,87 ± 0,39
Bổ sung Tween-80; 0,1% 21,86 ± 0,18
Trong nghiên cứu này, hàm lượng đường khử thu được từ thí nghiệm có bổ sung Tween-80, 0,1% là cao hơn so với thí nghiệm không bổ sung Tween- 80, 0,1%. Điều này cũng phù hợp những kết quả nghiên cứu về hoạt động của chất hoạt động bề mặt trong quá trình thủy phân. Trong thí nghiệm này có sử dụng Tween-80, 0,1% là một chất hoạt động bề mặt thuộc nhóm noninic có khả năng tăng tốc độ và mức độ đường hóa cellulose. Vì vậy, hàm lượng đường khử được tạo ra từ thí nghiệm có bổ sung Tween-80, 0,1% cao hơn hàm lượng đường khử từ thí nghiệm không bổ sung Tween-80, 0,1%.
3.5.2. Hoạt tính enzyme cellulase và xylanase
Cùng với việc theo dõi hàm lượng đường khử được tạo ra, ta tiến hành xác định hoạt tính của enzyme cellulase và xylanse. Kết quả xác định hoạt tính enzym cellulase và xylanse được trình bày ở bảng 3.16.
Bảng 3.16: Hoạt tính enzym cellulase và xylanase tạo ra khi bổ sung và không bổ sung Tween 80; 0,1%
Nghiệm thức Hoạt tính cellulase (IU/ml) Hoạt tính xylanase (IU/ml) Không bổ sung Tween 80; 0,1% 0,86 ± 0,03 2,72 ± 0,03
Bổ sung Tween 80; 0,1% 0,91 ± 0,01 3,48 ± 0,02 Từ bảng 3.16 vẽ được biểu đồ biểu diễn hoạt tính enzyme cellulase và xylanase như hình 3.8.
0.86 2.72 0.91 3.48 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00
Không bổ sung Bổ sung
Tween-80, 0,1% H o ạt t ín h e n zy m e ce llu la se và x yl an se ( IU /m l)
Hoạt tính cellulase (IU/ml) Hoạt tính xylanase (IU/ml)
Hình 3.8: Biểu đồ biểu diễn enzyme cellulase và xylanase tạo ra khi bổ sung và không bổ sung Tween 80; 0,1%
Chất hoạt động bề mặt như Tween 80, SDS, vv, đã được báo cáo để tăng cường hoạt tính của enzyme cellulase bằng cách tăng khả dụng của các chất dinh dưỡng. Cellulase có thể được sử dụng để đường hóa rơm để sản xuất ethanol sinh học, kết quả thử nghiệm 4 nồng độ của Tween 80 trong nghiên cứu và đã tìm thấy nồng độ 0,10% đã tăng cường các hoạt động cellulase. Tuy nhiên, sự ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt lên hoạt tính của enzyme xylanse ít được đề cặp đến nhưng kết quả thí nghiệm cho thấy hoạt tính của enzyme xylanse ở thí nghiệm có bổ sung Tween 80, 0,1% có hoạt tính cao hơn ở thí nghiệm không bổ sung Tween 80, 0,1% [21].
Các chất hoạt động bề mặt có thể sẽ tăng cường hoặc ức chế hoạt động của enzyme cellulose hoặc xylanase. Tween 80 là một chất hoạt động bề mặt có bản chất là nonionic là tăng cường hoạt động của enzyme. Xylanase và cellulase có thể được an toàn sử dụng cùng với chất hoạt động bề mặt có bản chất là nonionic trong quá trình thủy phân [24].
3.5.3. Hiệu suất phản ứng thủy phân rơm
Kết thúc quá trình thủy phân ta xác định khối lượng rơm sau khi thủy phân, từ đó tính được hiệu suất của quá trình thủy phân rơm. Kết quả được ghi nhận theo bảng 3.17
Bảng 3.17: Hiệu suất của quá trình thủy phân rơm
Nghiệm thức
pH = 4,5
Khối lượng rơm trước thủy phân
(g)
Khối lượng rơm sau thủy phân
(g)
Hiệu suất quá trình thủy phân rơm
(%)
NT 3 1,000 0,7893 21,07 ± 0,41
NT 4 1,000 0,7727 22,73 ± 0,36
NT3: Không bổ sung Tween 80; 0,1% NT4: Bổ sung Tween 80; 0,1%
Trong nghiên cứu này, hiệu suất thủy phân rơm thu được từ thí nghiệm