3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.2. Phương pháp thắ nghiệm trong nhà lưới
3.3.2.1. Phương pháp xác ựịnh chủng sinh lý (Race) của các mẫu phân lập nấm Pyricularia oryzae Cav.
đánh giá phản ứng bệnh ựạo ôn của 12 giống lúa chỉ thị của Nhật Bản với các mẫu nấm Pyricularia oryzae Cav. ựã phân lập bằng phương pháp lây nhiễm bệnh nhân tạo, mỗi giống lúa này ựều có gen kháng ựạo ôn khác nhau ựã ựược xác ựịnh và mã hoá bằng các chữ số.
Từ kết quả phản ứng của 12 giống lúa chỉ thị với các chủng ựã phân lập (isolate): Dựa trên mã số các giống và phản ứng kháng, nhiễm của chúng ựể xác ựịnh các chủng sinh lý (race) nấm Pyricularia oryzae Cav. bằng cách cộng tất cả các mã số của các giống lúa có khả năng nhiễm bệnh (vết bệnh cấp 3,4) lại với nhau theo thứ tự thập phân, hàng ựơn vị, hàng chục và hàng trăm.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 42
3.3.2.2. Phương pháp lây bệnh nhân tạo
* Chuẩn bị cây mạ
- Ngâm hạt lúa giống 36 giờ sau ựó ủ cho nảy mầm, ựem gieo vào các khay nhôm hoặc khay nhựa có bùn. Mỗi khay gieo bốn giống, mỗi giống gieo hai hàng, mỗi hàng 10 hạt, chăm sóc cho cây phát triển bình thường. Sau khi gieo 20-22 ngày (cây có khoảng 3-4 lá thật) thì phun dung dịch bào tử ựể lây bệnh.
* Chuẩn bị nguồn bào tử ựể lây nhiễm
- Lấy nấm từ ống nghiệm lưu giữ nguồn ựã phân lập cấy lên ựĩa petri chứa môi trường PSA, mỗi mẫu phân lập cấy 2 ựĩa, mỗi ựĩa cấy 3 ựiểm sau ựó ựặt ựĩa ựã cấy vào tủ ựịnh ôn 26-280C sau 2 tuần, lúc này sợi nấm sẽ mọc kắn môi trường.
- Lấy ựĩa nấm ra khỏi tủ, dùng bình tia phun nước cất vào, dùng chổi lông quét ựi, quét lại nhiều lần trên bề mặt ựĩa, dùng bình tia rửa hết sợi nấm, vẩy chổi cho hết nước quét khô mặt thạch (mỗi mẫu phân lập dùng một chổi, rửa xong luộc chổi trong nước sôi).
- đặt ựĩa nấm trong tủ 12 giờ sáng, 12 giờ tối sau 3 ngày ựể bào tử hình thành. Dùng 20ml nước vô trùng có pha Tween 20 tỷ lệ 1/10.000 ựể rửa và lọc lấy bào tử cho một ựĩa petri. Lấy 1 giọt dung dịch bào tử ựã rửa ở trên nhỏ lên lam kắnh soi dưới kắnh hiển vi. đếm số bào tử trên quang trường 10X. điều chỉnh dung dịch bào tử sao cho có khoảng 30-50 bào tử trên quang trường tương ựương với 105 bào tử/ml. (ựếm 5 quang trường 10X)
* Lây nhiễm
Sử dụng bình phun cầm tay loại dung tắch 0,5 lắt ựể phun dung dịch lên lúa, phun ướt ựều các lá lúa. Sau ựó ựặt khay lúa trong tủ lây nhiễm, phun và giữ ẩm liên tục trong 20 giờ (ẩm trên 90%), sau ựó ựem lúa ựã lây nhiễm ra khỏi tủ ẩm ựặt dưới ánh sáng tán xạ, tưới nước ựầy ựủ ựể lúa vẫn tiếp tục phát triển.
* đánh giá
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 43 theo thang phân cấp của Kato, 1993.
Cấp 0: không có vết bệnh, kháng cao (HR)
Cấp 1: vết bệnh là một chấm nhỏ bằng ựầu kim, kháng (R) Cấp 2: Vết bệnh to hơn màu nâu nhạt ựến nâu tối, kháng (MR) Cấp 3: Vết bệnh to hơn màu xám ở giữa vết bệnh, nhiễm (S)
Cấp 4: Vết bệnh ựiển hình (hình thoi có màu xám ở giữa), nhiễm nặng (HS) Cấp 0, 1, 2: kháng bệnh Cấp 3, 4: nhiễm bệnh