3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1. Phương pháp nghiên cứu trong phòng
3.3.1.1. Phương pháp phân lập nấm theo phương pháp ựơn bào tử
- Thu mẫu bệnh: Nhổ cả khóm lúa bị bệnh, ựem về trồng trong chậu riêng từng giống, ựể trong nhà lưới râm mát, dùng nhãn bằng giấy ghi tên giống lúa, ngày lấy mẫu, ựịa ựiểm lấy mẫu rồi buộc vào từng khóm lúa.
- Phân lập nấm Pyricularia oryzae:
Lấy lá lúa tươi có vết bệnh, rửa sạch dưới vòi nước, cho 1ml nước sạch vào ống nghiệm, cắm lá lúa vào trong ống nghiệm ựể 15-20 giờ bào tử sẽ ựược hình thành trên bề mặt vết bệnh, lấy lá lúa này ra khỏi ống nghiệm.
Lấy ựĩa WA (Water agar) cầm úp mặt thạch, gấp ựoạn lá hoặc cổ bông có vết bệnh theo hình tam giác. Dùng pank cặp và dắnh nhẹ vết bệnh vào bề mặt thạch ựể bào tử dắnh vào mặt ựĩa WA. Dùng bút dạ khoanh khu vực ựặt vết bệnh ựể khi ựưa lên kắnh hiển vi dễ quan sát bào tử. Dùng pank lấy một ắt bông thấm nước, nhúng vào cồn 96% rồi khử trùng kim thuỷ tinh, ô kắnh hiển vi.
đưa ựĩa WA có bào tử lên kắnh hiển vi quan sát và nhẹ nhàng lấy bào tử vào ựầu kim thuỷ tinh (ựiều chỉnh kắnh và kim thuỷ tinh sao cho mỗi lần khêu lấy chắnh xác một bào tử cấy). điều chỉnh cho vật kắnh lên cao, ựưa ựĩa
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 40 WA và cho ựĩa PSA vào theo chiều úp mặt thạch xuống phắa dưới, dùng bút dạ khoanh tròn 4 khoanh ở 4 góc của ựĩa, rồi từ từ thả bào tử từ ựầu kim thuỷ tinh vào nơi có ựánh dấu khoanh tròn trên ựĩa PSA. Mỗi khoanh tròn một bào tử (mỗi ựĩa PSA thả 4 bào tử).
đưa ựĩa có nấm vào buồng cấy vô trùng. Dùng que cấy cắt một miếng WA ựã có một bào tử dắnh ở ựó, cấy vào môi trường PSA trong ống nghiệm, ựể ở nhiệt ựộ 26oC Ờ 28oC cho nấm phát triển. đây là nguồn nấm Pyricularia
oryzae thuần dùng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.3.1.2. Phương pháp nghiên cứu khả năng phát triển nấm Pyricularia oryzae Cav. trên các môi trường nhân tạo
* Chuẩn bị 4 loại môi trường: PSA, OMA - Bước 1: Chuẩn bị ựĩa Petri
đĩa Petri rửa sạch, ựể khô, sấy ở 1600C trong 3 giờ. - Bước 2: Nấu môi trường:
+ Môi trường PSA: 200 gam khoai tây ựã gọt vỏ, cắt lát mỏng + 1.000 ml nước cất ựun sôi 30 phút sau ựó dùng lớp vải màn mỏng (2 lớp) lọc lấy nước khoai tây (PB = Potato Broth), thêm nước cất cho ựủ 1.000 ml ựun sôi cho vào 20 gam Sacarose, 20 gam agar vào ựun sôi cho tan.
- Bước 3: Hấp khử trùng:
Cho môi trường ựã chuẩn bị vào bình tam giác, bịt nút bông vô trùng, bọc nắp bằng giấy bạc, cho vào nồi hấp. Hấp ở 1210C trong 20 phút.
- Bước 4: đổ môi trường
Chờ cho bình nguội về 400C, lấy ra thêm 5 mg Steptomycine, lắc ựều rồi ựổ ra ựĩa petri.
* Chuẩn bị nguồn nấm: Cấy nấm từ ống nghiệm (ống nguồn) vào ựĩa petri chứa môi trường cám-agar (cấy 1 ựiểm ở chắnh giữa ựĩa) sau 4 - 6 ngày dùng ựĩa ựó ựể làm nguồn cấy nấm.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 41 chuẩn bị làm nguồn cấy ở trên, ta dùng ựột tròn có ựường kắnh 5 mm ựột nấm ở ựĩa theo ựường tròn ựồng tâm sau ựó dùng que cấy lấy từng khoanh cấy trên các môi trường ựã chuẩn bị (mỗi ựĩa cấy 1 khoanh ở chắnh giữa ựĩa petri, mỗi môi trường cấy 3 ựĩa.)
* Các chỉ tiêu theo dõi
- đo ựường kắnh của tản nấm sau 2, 4, 6, 8, 10 ngày, ựo gián tiếp ở phắa ngoài ựĩa petri, không mở hộp, ựo 2 lần theo chiều vuông góc ựĩa qua tâm của ựĩa theo hình dấu cộng (+)
- đo ựường kắnh của tản nấm 10 ngày sau khi cấy.
- Xác ựịnh số lượng bào tử ựược hình thành: Sau khi cấy 14 ngày, rửa sạch sợi nấm trên bề mặt ựĩa petri bằng chổi lông vô trùng và nước cất. để khô sau ựó ựặt ựĩa vào trong tủ ựể 12 giờ sáng, 12 giờ tối trong 3 ngày ựể nấm sinh bào tử. Sau ựó dùng 20 ml nước cất có Tween 20 tỷ lệ 1/10.000 ựể rửa và lọc lấy bào tử cho vào 1 hộp petri, lấy 1 giọt dung dịch bào tử nhỏ lên buồng ựếm hồng cầu ựưa lên kắnh hiển vi quan sát, ựếm bào tử của 5 quang trường X10, sau ựó tắnh số bào tử/ml.