2.2.1. Phương pháp phân tích hóa học 2.2.1.1. Phương pháp xác định độ ẩm
Độ ẩm của mẫu được xác định bằng phương pháp sấy khô đến trọng lượng không đổi theo TCVN 5567: 1991 [14].
2.2.1.2. Phương pháp xác định hoạt độ nước
Hoạt độ nước của sản phẩm được xác định bằng máy đo hoạt độ nước HYGROLAB C1 của Rotronic.
2.2.1.3. Phương pháp nghiên cứu chlorophyll * Phương pháp thu nhận chlorophyll
- Lá bắp sau khi thu hoạch, tiến hành sơ chế lựa chọn các lá còn màu xanh sáng, không bị úa vàng, rửa sạch bùn đất, cát, v,v… để ráo nước rồi đem cắt nhỏ đến 1cm để tiến hành ngâm chiết.
- Thu nhận dịch chiết chlorophyll theo kỹ thuật chiết đã được đề tài “Xây dựng quy trình chiết xuất, sản xuất đồ uống giàu polyphenol, chlorophyll từ cây bắp” do
ThS Đặng Xuân Cường nghiên cứu theo trình bày hình 3.1. Sau đó được bảo quản ở nhiệt độ <4oC và tránh ánh sáng để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
* Phương pháp phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của dịch chiết
Dịch chiết thu được sau khi cô đặc sẽ được phân tích định tính một số thành phần hóa thực vật cụ thể ở bảng 2.1 như sau:
Bảng 2.1. Các phương pháp định tính một số thành phần hóa thực vật trong dịch chiết chlorophyll [12]
STT Tên hoạt chất Thuốc thử -Phương pháp thực hiện
1 Terpenoid Liebermann-Burchard 2 Lipid Nhỏ dung dịch lên giấy 3 Tinh dầu Bốc hơi tới cặn
4 Flavonoid Mg/HCl đậm đặc
* Phương pháp chuẩn bị dịch chlorophyll dùng trong sấy phun
Cân một lượng chất mang theo tỷ lệ đã lựa chọn cho vào bình định mức 1000ml, cho 1 lượng nước cất, khuấy cho hòa tan hoàn toàn chất mang và dẫn nước cho đủ định mức đủ 250ml (có bọc giấy tráng bạc bên ngoài). Thêm vào 350ml dịch chiết đã cô đặc và tiến hành đồng hóa gỗn hợp trong 5 phút với tốc độ đồng hóa 3000 vòng/phút cho đến khi phân tán hoàn toàn và lọc qua vải sạch có đường kính lỗ khoảng 0,5mm để loại bỏ phần kích thước lớn trước khi sấy.
* Phương pháp phân tích định lượng chlorophyll + Trong dịch chiết
Sử dụng dịch chiết chlorophyll trong ethanol 96% và đo độ hấp thu của dung dịch ở bước sóng 664,1nm và 648,6nm trên máy đo hấp thụ quang phổ UV-Vis Varian Cary100 Bio EL 08023609. Mẫu trắng là mẫu chỉ chứa dung môi ethanol 96%. Nồng độ Chl được tính theo công thức (2.1) của Lichtenthaler H. K. [56] như sau:
gchl a / mL = (13,36 A664,1 - 5,19 A648,6)
gchl b / mL = (27,43 A648,6 - 8,12 A664,1)
Trong đó: A648,6 và A664,1 là độ hấp thu quang tại bước sóng 648,6nm và 664,1nm.
+ Trong chế phẩm chlorophyll và trà hòa tan
Cân 1g bột chế phẩm/ trà hòa tan thu nhận theo phương pháp trên hòa tan trong 100ml ethanol 96%, dùng đũa thủy tinh khuấy đều trong khoảng 10 phút cho các hạt phá vỡ cấu trúc (tạo tủa trắng nếu là maltodextrin), sau đó để yên đến khi lắng phần tủa hoặc đem ly tâm lạnh. Tiến hành lọc qua giấy lọc để bỏ phần tủa và xác định hàm lượng Chl trong phần dịch theo phương pháp như ở trên.
* Phương pháp sấy thu nhận chế phẩm chlorophyll
Để thu nhận chế phẩm bột Chl từ dịch chiết, chúng tôi dùng phương pháp sấy phun trên máy sấy phun LabPlant SD 05 sau khi sử dụng chất để tạo hệ nhũ cùng với chất mang.
* Xác định hiệu suất thu hồi (hay còn gọi là hiệu suất bao gói -Encapsulation
efficiency - EE)
Phương pháp này được mô tả bởi Shu cùng cộng sự (2006) [89]: hiệu suất thu hồi (%) được xác định là tỷ lệ giữa hàm lượng Chl tổng của sản phẩm bột cuối cùng và hàm lượng Chl tổng ban đầu trước khi sấy phun.
* Xác định khả năng hòa tan của chế phẩm
Khả năng hòa tan của chế phẩm Chl được xác định theo phương pháp được mô tả bởi Goula A. M. cùng cộng sự (2008) [44]: Lấy 2 gram bột sấy phun cho vào 50ml nước cất trong cốc thủy tinh 100ml ở nhiệt độ phòng. Khuấy đều trên máy khuấy từ ở 892 vòng/phút, sử dụng thanh khuấy với kích thước 2mm x 7mm và ghi lại thời gian cần thiết để bột Chl hòa tan hoàn toàn.
* Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa tổng
Hoạt tính chống oxy hóa tổng (TAA) được xác định theo phương pháp của Prieto (1999) [73]. Lấy 100µl mẫu bổ sung 900µl nước cất và thêm 3 ml dung dịch A (H2SO4
0,6 M, sodium phosphate 28 mM và ammonium Molybdate 4 mM). Hỗn hợp được giữ 90 phút ở 95oC. Sau đó đo ở bước sóng 695nm với chất chuẩn là acid ascorbic.
* Phương pháp đánh giá hoạt tính khử sắt
Hoạt tính khử sắt (RP) của chế phẩm được xác định theo phương pháp của Zhu và cộng sự (2002) [98]. Lấy 500µl dịch mẫu bổ sung 0,5ml đệm phosphate pH = 7,2 và 0,2ml K3[Fe(CN)6] 1%. Giữ hỗn hợp 20 phút ở 500C. Sau đó thêm vào 500µl CCl3COOH 10% và bổ sung 300µl nước cất, 80µl FeCl3 0,1%. Tiếp theo đo ở bước sóng 655nm với chất chuẩn là FeSO4.
* Phương pháp đánh giá khả năng bắt gốc tự do
Khả năng bắt gốc tự do (DPPH) được tiến hành theo Blois M. S. (1958) [26]. Cụ thể như sau:
Lấy lần lượt 200µl, 400µl, 600µl, 800µl và 1000µl dịch chiết vào 5 ống nghiệm, rồi bổ sung 3ml DPPH (25mg/l) vào từng ống nghiệm làm dung dịch mẫu (mẫu). Ở dung dịch trắng (mẫu trắng) làm tương tự nhưng thay DPPH bằng 3ml cồn tuyệt đối vào từng ống. Mẫu kiểm soát chuẩn bị bằng cách làm giống như mẫu trắng nhưng thay dịch chiết bằng DPPH. Giữ các hỗn hợp trong tối ở nhiệt độ phòng. Sau 30 phút tiến hành đo ở bước sóng 550nm. Phần trăm bắt gốc tự do được tính theo công thức (2.2) như sau: % 100 1 % kiemsoat mautrang mau A A A A
Trong đó: Amau, Amautrang và Akiemsoat làgiá trị hấp thu ở bước sóng 550nm của các mẫu tương ứng.
2.2.2. Phương pháp phân tích vi sinh
- Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí: theo tiêu chuẩn ISO 6887-1 (9/1999). - Xác định Escherichia coli: theo tiêu chuẩn ISO/TS 16649-3:2005.
- Xác định Staphylococcus aureus: theo tiêu chuẩn ISO 6888 -3:2003. - Xác định Coliforms: theo tiêu chuẩn ISO 4831:2006 (TCVN 4882:2007) - Xác định Bacillus cereus: theo tiêu chuẩn ISO 6579:2002.
- Xác định Clostridium perfringens: theo tiêu chuẩn ISO 7937 (2/2005). - Xác định tổng số bào tử nấm men – nấm mốc theo TCVN 8275-1:2010.
2.2.3. Phương pháp phân tích cảm quan
Đánh giá cảm quan theo phương pháp cho điểm được quy định trong tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN 3215 - 79) [13]. Sử dụng hệ điểm 20, thang điểm 6 bậc (từ 0 đến 5) và điểm cao nhất cho mỗi chỉ tiêu là 5 điểm. (Phụ lục 2)
2.2.4. Phương pháp bố trí thí nghiệm
2.2.4.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm tổng quát
Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát được trình bày ở hình 2.1.
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát * Giải thích sơ đồ nghiên cứu
Dịch chiết chlorophyll
Dịch chiết Chl được chiết từ lá Bắp bằng dung môi chiết là ethanol 96% với điều kiện: tỷ lệ dung môi : nguyên liệu là 29 : 1 (v/w); bổ sung MgCO3 với lượng chiếm khoảng 0,05% so với khối lượng mẫu đem chiết; thời gian chiết 29 giờ, ở điều kiện nhiệt độ 53oC, tránh ánh sáng. Dịch chiết được lọc tách cặn và bảo quản ở điều kiện nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng. Dịch chiết được cô đặc bằng máy cô quay chân không trong điều kiện nhiệt độ 50oC, áp suất 100mbar để cô đặc dung dịch và quá trình cô đặc kết thúc khi dịch cô có nồng độ chất khô đạt 20±1oBrix.
Phối trộn chất hỗ trợ sấy
Lấy một lượng chất mang theo tỷ lệ nhất định hòa tan trong nước cất sau đó đem phối trộn với lượng dịch mẫu theo tỷ lệ dịch chiết/nước là 6/4 (v/v) và tiến hành đồng hóa cho đến khi nhũ hóa hoàn toàn dịch để sử dụng cho nghiên cứu sấy phun.
- Xác định hàm lượng Chl, hoạt tính chống oxy hóa (TA, RP, DPPH)
- Đánh giá chất lượng cảm quan, trạng thái, độ ẩm, khả năng hòa tan
- Kiểm tra vi sinh vật theo TCVN
Phối trộn chất mang
Sấy phun Phối trộn
Bảo quản
Dịch chiết Chlorophyll - Xác định hàm lượng Chl - Xác định hoạt tính chống oxy hóa (TAA, RP, DPPH)
Sấy phun
Dùng mẫu đã chuẩn bị ở trên để nghiên cứu xác đinh các thông số tối ưu cho quá trình sấy phun trên máy sấy Lab Plant SD 05. Chế phẩm sau sấy được bảo quản ở nhiệt độ 4oC để dùng cho việc phân tích, đánh giá chất lượng sản phẩm, các chỉ tiêu liên quan và các thí nghiệm tiếp theo.
Phối trộn tạo bột trà hòa tan
Trà hòa tan được được phối trộn giữa chế phẩm Chl với các thành phần khác như đường aspartame; ascorbic acid theo các tỷ lệ khác nhau.
Bao gói, bảo quản
Chế phẩm sau khi sấy được bao gói và bảo quản tránh ánh sáng ở nhiệt độ 4±1oC cho đến khi được đánh giá chất lượng. Việc đánh giá chất lượng sản phẩm được tiến hành sau khi thu mẫu, hoặc trong vòng 4h sau đó và định kỳ trong thời gian bảo quản.
2.2.4.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm xác định các thông số thích hợp cho quá trình sấy thu nhận chế phẩm chlorophyll
Để sấy thu nhận chế phẩm giàu Chl từ dịch chiết của lá Bắp, chúng tôi tiến hành sấy trên máy sấy phun Labplant SD 05 với một số các thông số cụ thể để khảo sát như sau: loại chất mang, tỷ lệ chất mang, nhiệt độ khí đầu vào, tốc độ bơm dịch, tốc độ dòng khí, áp suất khí nén [68]. Tuy nhiên qua nghiên cứu tài liệu liên quan thì khả năng làm khô là thay đổi tương ứng với lượng không khí khô, hoạt động của không khí quyết định tộc độ và mức độ khô của các giọt nhỏ, nên tốc độ dòng khí sấy phải là cực đại trong tất cả các trường hợp [74]. Chính vì vậy, ở đây chúng tôi chỉ chọn một số thông số sau để khảo sát trong nghiên cứu này: loại chất mang, nhiệt độ khí đầu vào, tỷ lệ chất mang, tốc độ bơm dịch, áp suất khí nén. Tất cả các mẫu dịch nạp liệu đều ở nhiệt độ phòng.
Sản phẩm thu được đều phải tiến hành bao gói và bảo quản ngay trước khi tiến hành đánh giá xác định các chỉ tiêu về: hàm lượng Chl, hoạt tính chống oxy hóa (TAA, RP, DPPH), trạng thái cảm quan, khả năng hòa tan, độ ẩm và vi sinh vật. Tất cả các thí nghiệm đều được thực hiện trong ba lần.
* Bố trí thí nghiệm chọn loại chất mang
Sản phẩm bột tạo ra không chỉ yêu cầu có hàm lượng Chl cao mà còn cần có trạng thái đặc trưng của sản phẩm (mịn, tơi, có khả năng hòa tan tốt trong nước, màu xanh đặc trưng và hương thơm tự nhiên của bắp) cũng như các hoạt tính chống oxy hóa của nó. Qua nghiên cứu các tài liệu khoa học trong nước cũng như trên thế giới thì các chất mang được sử dụng là các chất có khả năng bao gói tốt cũng như có khả năng
tương tác với các hoạt chất và có khả năng đáp ứng được các đặc trưng của sản phẩm. Chính vì vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng các loại chất mang như maltodextrin, dextrose và sucrose để khảo sát. Tại thí nghiệm này, một số điều kiện đầu vào được cố định như sau:
- Thể tích dịch sấy: 600ml; - Tốc độ bơm nhập liệu: 10 vòng/phút (350 ml/h); - Áp suất khí nén 1,0 bar; - Nhiệt độ sấy đầu vào 120 oC;
Các loại chất mang maltodextrin, dextrose và sucrose ở tỷ lệ 10% so với tổng dịch trước khi sấy phun (w/v) là được nghiên cứu. Sản phẩm thu được đánh giá chất lượng theo hình 2.1.
Hình 2.2: Bố trí thí nghiệm chọn loại chất mang * Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn nhiệt độ của không khí đầu vào
Nhiệt độ đầu vào của không khí sấy có ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng sản phẩm, nhất là các đặc tính hóa lý của bột thu được.
Tại thí nghiệm này, một số điều kiện đầu vào được cố định như sau: - Thể tích dịch sấy: 600ml; - Tốc độ bơm nhập liệu: 350 ml/h;
- Áp suất khí nén 1,0 bar; - Tỷ lệ của chất mang thích hợp: 10% (w/v); Nhiệt độ không khí đầu vào được nghiên cứu trong khoảng 100140±10C với bước nhảy là 10±10C. Sản phẩm đầu ra được đánh giá dựa vào một số hàm mục tiêu theo hình 2.1. Sucrose Maltodextrin Dextrose Phối trộn Dịch chiết Đánh giá chất lượng sản phẩm và chọn chất mang thích hợp Sấy phun
Hình 2.3. Bố trí thí nghiệm chọn nhiệt độ khí đầu vào * Bố trí thí nghiệm chọn tỷ lệ bổ sung chất mang
Ở điều kiện đã được lựa chọn ở trên, tỷ lệ chất mangthích hợp/ tổng thể tích dịch chiết (w/v) tương ứng lần lượt là 5%, 10%, 15%, 20% và 25% với bước nhảy là 5±1% là được tiến hành thí nghiệm khảo sát. Sơ đồ bồ trí thí nghiệm như hình 2.4:
Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm chọn tỷ lệ bổ sung chất mang
Đánh giá chất lượng sản phẩm và chọn tỷ lệ phù hợp Sấy phun 15% 10% 20% 25% 5% Phối trộn Dịch chiết Sấy phun Phối trộn Dịch chiết 120oC 100oC 110oC 130oC 140oC Đánh giá chất lượng sản phẩm và chọn nhiệt độ thích hợp
* Bố trí thí nghiệm chọn áp suất khí nén
Khí nén có nhiệm vụ làm quay đầu phun sương, tạo các giọt dịch trong buồng sấy. Áp suất khí nén càng tăng thì tốc độ quay của đầu phun càng tăng. Nên có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sấy cũng như các đặc tính của chế phẩm thu được. Ở điều kiện đã lựa chọn một số thông số thích hợp ở trên (loại chất mang, tỷ lệ bổ sung, nhiệt độ khí đầu vào), tiếp tục tiến hành thí nghiệm nghiên cứu sấy phun với các áp suất khí nén được khác nhau là được khảo sát. Cụ thể ở hình 2.5:
Hình 2.5. Bố trí thí nghiệm chọn áp suất khí nén * Bố trí thí nghiệm chọn tốc độ bơm nhập liệu
Tốc độ bơm nạp liệu có ảnh hưởng lớn đến khả năng sấy sản phẩm. Vì nó ảnh hưởng đến lưu lượng dòng nạp liệu, nhiệt độ đầu ra và năng suất thiết bị. Tốc độ bơm tăng đồng nghĩa lượng dịch được bơm vào buồng sấy tăng và với thời gian lưu của vật liệu sấy trong buồng sấy giảm, thời gian tiếp xúc của các hạt vật liệu sấy với không khí sấy ngắn, làm cho lượng hơi nước thoát ra không triệt để và sẽ dẫn tới ảnh hưởng đến chất lượng của chế phẩm sau sấy.
Ở điều kiện đã được lựa chọn ở trên. Tiến hành sấy phun với tốc độ bơm nhập liệu thay đổi lần lượt là 10, 15 và 20 vòng/phút tương ứng với lưu lượng dịch là 350, 475 và 600 ml/h. Phối trộn Dịch chiết Sấy phun 1,0bar 0,8bar 1,2bar Đánh giá chất lượng sản phẩm và chọn áp suất phù hợp
Hình 2.6. Bố trí thí nghiệm chọn tốc độ bơm nhập liệu 2.2.4.3. Bố trí thí nghiệm phối chế tạo trà hòa tan chlorophyll
Sau khi tham khảo các tài liệu liên quan, các loại sản phẩm trà hòa tan và các sản phẩm đồ uống đã có trên thị trường cũng như các quy chuẩn của về chất phụ gia trong thực phẩm, các tiêu chuẩn chất lượng thực phẩm trong và ngoài nuớc, chúng tôi dự kiến tạo ra sản phẩm trà hòa tan từ chế phẩm Chl của lá Bắp sẽ có một số đặc tính chính sau:
+ Về trạng thái: Dạng bột mịn, nước pha không có cặn, ổn định + Về khả năng hoà tan: Tan tốt trong nước
+ Về màu sắc: Có màu xanh sáng đặc trưng của chlorophyll và ổn định + Về mùi: Có mùi thơm dịu đặc trưng của Bắp
+ Về vị: Vị ngọt của đường kết hợp vị chua nhẹ của ascorbic acid. Vì vậy, công thức phối chế dự kiến cụ thể như sau:
Để đánh giá ảnh hưởng của chất phụ gia đến chất lượng sản phẩm trà hòa tan, tỷ lệ bổ sung đường aspartime và ascorbic acid vào chế phẩm là được khảo sát. Chế phẩm bột Chl thu được đem trộn với đường aspartime theo tỷ lệ khối lượng chế phẩm/tổng khối lượng tương ứng lần lượt là 0,1 0,5% (w/w). Đồng thời bổ sung