Có 4 kỹ thuật để xác định Chl a trong phiêu sinh: - Trắc quang
- Huỳnh quang
- Sắc ký lỏng hiệu năng (HPCL) - Điện hóa
Chlorophyll có quang phổ huỳnh quang riêng biệt, đặc trưng của môi trường mà chúng tồn tại. Phổ huỳnh quang có thể tiết lộ một số lượng lớn các thông tin về các tính chất vật lý của Chl và vai trò của chúng trong quá trình quang hợp, nhưng so với sự hấp thụ quang phổ, huỳnh quang đã không được sử dụng rộng rãi trong việc xác định hay ước lượng của chúng. Phương pháp huỳnh quang có độ nhạy cao hơn trắc quang. Vì vậy các mẫu có hàm lượng Chl a nhỏ thì ưu tiên sử dụng phương pháp huỳnh quang. HPLC là phương pháp sử dụng thiết bị phức tạp hơn, nhưng vẫn dựa trên nguyên tắc của phương pháp huỳnh quang và trắc quang. Phương pháp điện hóa xác định Chl a bằng cực phổ tuần hoàn trực tiếp bằng điện cực màng cacbon (SPCE) thu được mũi đơn thuận nghịch oxy hóa tại cực dương ở Ep = +400mV, điện cực so sánh là Ag/AgCl. Theo nghiên cứu điện hóa cho kết quả là Chl a hấp thụ lên bề mặt màng SPCE. Hiện tượng hút bám này cho phép phát triển phương pháp xác định Chl a dựa trên sự trao đổi trung gian bằng cực phổ tích góp hòa tan (Absorbtion Stripping Voltammetry - AdSV). Phương thức cuối cùng để tối ưu phương pháp là khảo sát pH của dung dịch đệm/tích góp, thời gian tích góp và lượng acetone của đệm tích góp. Sử dụng phương thức tối ưu này để có thể xác định Chl a trong dung dịch đệm phosphate với nồng độ trong khoảng 0,014 – 2,24 M. Mỗi phương pháp đều có ưu và nhược điểm riêng của chúng, tùy vào điều kiện thực tế, mục đích cụ thể có thể sử dụng từng phương pháp để đạt được kết quả có độ chính xác là cao nhất [6].
Cơ sở để định lượng quang phổ của các sắc tố là định luật Lambert-Beer, việc xác định độ hấp thụ của dung dịch đối với các đặc tính dễ hấp thụ cụ thể của một hợp chất hòa tan với bước sóng riêng lẻ: A = cwd hoặc A = cmd [55, 56]
Phương pháp truyền thống để định lượng Chl và các sắc tố khác trong một dịch chiết cụ thể là phân tích quang phổ [81]. Các hợp chất diệp lục khác nhau và các chất màu khác được định lượng bằng cách đo độ hấp thụ của mẫu ở các bước sóng đặc biệt và sử dụng xây dựng hệ phương trình đặc biệt để tính toán nồng độ sắc tố [59].
Công thức tính nồng độ Chl (mg/g) được viết ở dạng sau: Ca = A 1 + A 2
Cb = A 3 + A 4
Trong đó: - , , , : những hệ số phu thuộc vào dung môi - Ca, Cb: nồng độ tương ứng của Chlorophyll a và b
Giá trị của các hệ số phụ thuộc vào dung môi, do đó với mỗi dung môi khác nhau có một công thức tính riêng [56]:
+ Đối với dung dịch acetone với 20% (v/v) nước: - Theo phương pháp của Mackinney-Arnon:
Ca = 12,7 A 663 - 2,69 A 645
Cb = 22,9 A 645 - 4,68 A 663
- Theo Vernon: Ca = 11,63 A665 - 2,69 A649
Cb = 20,11 A649 - 5,18 A665
+ Đối với dung dịch acetone khan:
- Theo Honma: Ca = 9,784 A662 - 0,990 A644
Cb = 21,462 A644 - 4,65 A662
- Theo Sluk: Ca = 11,70 A662 - 2,09 A644
Cb = 21,19 A644 - 4,56 A662
+ Đối với dung dịch ether etylic:
- Theo Komar - Cigeil: Ca = 9,93 A660 - 0,777 A642,5
Cb = 17,6 A642,5 - 2,81 A660
- Theo Smit - Benitei: Ca = 10,1 A662 - 1,01 A644
Cb = 16,4 A644 - 2,57 A662
+ Đối với dung dịch ethanol 96%:
- Theo Mackinney: Ca = 13,7 A665 - 5,76 A649
Cb = 25,8 A649 - 7,6 A665
- Theo Lichtenthaler H. K.: Ca = 13,36 A664,2 - 5,19 A648,6
Bảng 1.4: Nồng độ chlorophyll được tính theo công thức tương ứng với các dung môi và phương pháp khác nhau [70]
Phương pháp Dung môi Công thức
Mackinney [57] Methanol gchl / mL= 13,43 A 665 v / lV
Porra et al. [71] Methanol gchl / mL= (16,29 A665 – 8,54A652) v/ lV Methanol gchla+b/ mL= (22,12 A652 + 2,71A665) v/ lV Lichtenthaler
[55] Methanol g
chl / mL= (16,72 A665 – 9,16A652) v/ lV Jeffrey và
Humphrey [50] Acetone gchl / mL=(11,85 A664 – 1,54A647 – 0,08A630)v/ lV Strickland và
Parsons [91] Acetone gchl / mL=(11,66 A665 – 1,31A645 – 0,14A630)v/ lV SCOR/UNESCO
[93] Acetone gchl / mL=(11,64 A663 – 2,16A645 – 0,10A630)v/ lV Lichtenthaler
[55] Ethanol
gchl a / mL= (13,36 A664,1 - 5,19 A648,6)
gchl b / mL= (= 27,43 A648,6 - 8,12 A664,1)
Trong đó: Axxx là độ hấp thu quang tại bước sóng xxx, sau khi loại bỏ các mẫu hấp thụ ở bước sóng 750nm, với mẫu trắng là dung môi được sử dụng. v là lượng dung môi sử dụng (ml), l là chiều dày tế bào quang phổ (cm), V là thể tích mẫu (ml), DW là trọng lượng khô của mẫu chiết (mg).