4. Ý nghĩa khoa học
1.3.2.Nghiên cứu về DREB5 bằng phƣơng pháp RT-PCR
Phản ứng RT-PCR (PCR ngƣợc)
Thực chất của RT-PCR là phản ứng nhân trình tự DNA từ khuôn RNA, gồm 2 giai đoạn:
(1)Tổng hợp trình tự DNA từ sợi RNA làm khuôn
(2) Trình tự DNA 2 sợi làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR
Phản ứng biến đổi RNA thành DNA phải nhờ enzyme phiên mã ngƣợc (Reverse-trancriptase) đƣợc gọi là giai đoạn chuyển ngƣợc (RT) thực hiện ở nhiệt độ 500
-550 trong 30 phút. Sau đó có sản phẩm DNA 2 sợi thì phản ứng tiếp theo là PCR thông thƣờng gồm 3 giai đoạn. RT-PCR đƣợc sử dụng để nhân RNA của retrovirus hoặc mRNA tách từ tế bào chất.
-Giai đoạn 2 (RT) 1 chu kì thực hiện sao chép ngƣợc từ RNA sợi đơn sang DNA sợi kép ở nhiệt độ 500-550C, trong 30 phút.
-Giai đoạn 2 (PCR): (1) Biến tính ở nhiệt độ 940-950C/1 phút. (2) Tiếp hợp mồi ở 400-650C.
(3) Tổng hợp DNA ở 720C/1 phút.
Cấu trúc mũ đầu 5'
AAA(A)n đuôi poly(A) đầu 3' mRNA
Cấu trúc mũ đầu 5'
AAA(A)n đuôi poly(A) đầu 3' Oligo(dT)12-18 primer 3'-OH 5'
dNTP Reverse transcriptase
AAA(A)n đuôi poly(A) đầu 3' Oligo(dT)12-18 primer 3'-OH 5'
5' 3'
cDNA : mRNA
Việc phân lập một gen nào đó thƣờng sử dụng phản ứng PCR, tuy nhiên PCR thu đƣợc sản phẩm chứa đoạn không mã hóa protein (intron), để không có đoạn intron ngƣời ta dùng phản ứng RT-PCR đi từ khuôn ban đầu là RNA.
Trên thế giới đặc biệt những nƣớc có nền khoa học phát triển mạnh nhƣ Mỹ, Đức, Nhật bản và hiện nay là Trung quốc đang có những quan tâm lớn đến vấn đề này, các nhà khoa học đang tìm lời giải hữu hiệu cho vấn đề hạn hán của cây trồng do trái đất đang nóng dần lên. Các công trình nghiên cứu về gen DREB ở cây trồng thông qua phản ứng RT-PCR tiêu biểu có thể kể đến Yanwen Xiong (2007) phân lập gen DREB1A trên đối tƣợng lúa, Stolf-Moreira et al (2009) đã phân lập thành công gen DREB1 và DREB2 trên đối tƣợng đậu tƣơng suy đoán các gen này mã hóa protein có khối lƣợng lần lƣợt là 24,2 và 37,7 kDa, Chen, M et al (2007) đã đọc trình tự thành công gen DREB5 trên đối tƣợng đậu tƣơng đây cũng là chuỗi gen DREB duy nhất công bố ở Genbank.
Ở Việt Nam vấn đề nghiên cứu DREB vẫn còn rất mới mẻ, chƣa có công trình nào công bố liên quan đến gen DREB chính vì vậy việc nghiên cứu gen DREB hiện nay là rất cần thiết tạo nguyên liệu cơ bản cho các nghiên cứu ứng dụng và chuyển gen ở cây đậu tƣơng.
Chƣơng 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1.VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU