4. Ý nghĩa khoa học
2.2.2.2. Kỹ thuật RT-PCR
Sau khi tách chiết và kiểm tra đƣợc độ tinh sạch của RNA tiến hành nhân gen DREB5 bằng kỹ thuật RT-PCR thực chất là PCR ngƣợc, gồm 2 giai đoạn chính là tạo cDNA và PCR với cặp mồi đặc hiệu.
Trình tự cặp mồi nhân gen DREB5 Mồi xuôi
DREBsoy5F: 5'-ATGCAATTCCCTCACCAATT-3' Mồi ngƣợc
DREBsoy5R: 5'-TCAATCCTGATCCTTCCACA-3'
Thành phần, chu kỳ nhiệt cho phản ứng RT-PCR đƣợc trình bày trong bảng 2.3 và bảng 2.4.
Bộ kit và hóa chất dùng cho phản ứng RT-PCR do hãng Invitrogen cung cấp.
Bảng 2.2: Thành phần hóa chất của phản ứng RT-PCR
Tên hóa chất Thể tích
Buffer 2x reaction mix 25,0 l
Enzym sao chép ngƣợc (RT) 1,0 l
Mồi xuôi (H5BAMF) (10pmol) 1,5 l
Mồi ngƣợc (H5NOTR) (10pmol) 1,5 l
Khuôn RNA 3,0 l
Nƣớc tinh khiết 18,0 l
Hỗn hợp phản ứng RT-PCR (Bảng 2.1) đƣợc trộn chung vào một ống PCR loại 0,2 ml sạch và đƣợc thực hiện trên máy PCR với chu kỳ nhiệt nhƣ bảng 2.2.
Bảng 2.3. Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR
Các bƣớc Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ
Bƣớc 1 42oC 60 phút 1 chu kỳ Bƣớc 2 95oC 15 phút 1 chu kỳ Bƣớc 3 94oC 1 phút 35 chu kỳ Bƣớc 4 55oC 1 phút Bƣớc 5 72oC 2 phút Bƣớc 6 72oC 10 phút 1 chu kỳ Bảo quản sản phẩm ở 4o C.
RT-PCR: (Reverse Transcriptase emzym sao chép ngƣợc) gồm:
Bƣớc 1: Ở 42oC là giai đoạn chuyển đổi RNA thành cDNA cho phản ứng PCR.
Bƣớc 2: Phản ứng PCR khuếch đại gen từ cDNA.
Sản phẩm RT-PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1% trong TAE 1X, với sự có mặt của marker chuẩn và chụp ảnh dƣới ánh sáng cực tím. Sau đó, sản phẩm đƣợc tinh sạch (thôi gel) theo bộ Kit DNA extraction Kit K05013 của hãng Fermentas.
Thành phần phản ứng PCR cho đọc trình trình tự gen Bảng 2.4: Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt PCR Thành phần phản ứng Chu trình nhiệt 96oC - 5 phút 96oC – 30 giây 50oC- 15 giây 30 chukỳ 68oC- 4 phút Cất giữ ở 4oC 2.2.2.3. Phƣơng pháp tinh sạch sản phẩm RT-PCR
- Điện di sản phẩm RT-PCR trên gel agarose 1% và cắt lấy băng quan tâm có kích thƣớc khoảng 927 bp cho vào ống eppendort 1,5 ml .
- Bổ sung 1000µl dung dịch Binding esdution.
- Ủ ở 550C trong khoảng 20 phút, 5 phút trộn nhẹ một lần cho gel tan hoàn toàn thành dịch trong suốt.
- Bổ sung 5 - 10µl Silica power vào và ủ sản phẩm ở 550C khoảng 5 phút rồi vontex khoảng 2 phút.
- Li tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút, loại dịch nổi, thu cặn màu trắng. - Bổ sung tiếp khoảng 500µl Buffer wash, vontex 2 phút. Li tâm 10000
vòng/phút trong 1 phút để loại dịch nổi, thu tủa (bƣớc này lặp lại 3 lần). Thành phần Thể tích (l) Mồi (1pmol) 3.2 l Nƣớc 3 l Khuôn DNA 2.8 l Big Dye 1 l Enhancer (1X) 10 l Tổng 20 l
- Làm khô DNA trong box.
- Hoà tan cDNA trong 20µl H2O deion khử trùng rồi ủ sản phẩm ở 550
C trong 5 - 10 phút.
- Li tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút để thu dịch nổi, bỏ tủa.
- Điện di kiểm tra sản phẩm thôi gel trên gel agarose 1%. Sản phẩm điện di đƣợc nhuộm bằng ethidium bromide, soi và chụp ảnh dƣới ánh sáng cực tím.
2.2.2.4. Phƣơng pháp gắn gen vào vector tách dòng
Sản phẩm PCR sau khi đƣợc tinh sạch sẽ đƣợc gắn trực tiếp vào vector tách dòng pCR®2.1-TOPO® với bộ Kit TOPO-TA cloning (Invitrogen) (Hình 2.1). Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng pCR®
2.1-TOPO® đƣợc thể hiện ở bảng 2.5.
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng pCR®
2.1-TOPO®
Tên hóa chất Thể tích (µl)
Buffer 10X 1
Vector pCR®2.1-TOPO® 1
Enzym T4-ligase 1
Nƣớc tinh khiết (khử ion) 4
cDNA sản phẩm RT-PCR 3
Tổng thể tích: 10
Hỗn hợp đƣợc ủ ở 220
C trong 1h, sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α
pCR®2.1-TOPO®
3931 nucleotides
Hình 2.1. Sơ đồ cấu tạo vector pCR®
2.1-TOPO® (Invitrogen)
2.2.2.5. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α
Bổ sung 7µl vector đã gắn gen vào ống đựng tế bào khả biến và trộn nhẹ. Đặt hỗn hợp vào đá trong 30 phút, rồi ủ ở 420C chính xác 1 phút. Sau đó tiếp tục đặt hỗn hợp vào đá 5 phút. Bổ sung 400µl môi trƣờng LB lỏng (pepton, cao nấm men, NaCl) vào hỗn hợp rồi đem hỗn hợp nuôi lắc 200 vòng/phút trong 1 giờ ở 370C. Sử dụng que cấy trải, trải 200µl dịch khuẩn lên đĩa môi trƣờng LB đặc (pepton, cao nấm men, NaCl, agarose) có chứa kháng sinh ampicillin (100mg/l),
khuẩn lạc có màu trắng nuôi trong môi trƣờng LB lỏng (có bổ sung ampicillin) qua đêm.
2.2.2.6. Phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (clony-PCR)
Lấy dịch nuôi chứa vi khuẩn kiểm tra sản phẩm chọn dòng bằng phản ứng PCR với cặp mồi pUC 18, đây là cặp mồi đƣợc thiết kế chung cho các vector tách dòng, nó nằm trên vector và nhân đoạn gen vừa biến nạp.
Thành phần của phản ứng clony-PCR tƣơng tự nhƣ trong phản ứng PCR chỉ khác cặp mồi sử dụng và mẫu DNA thay bằng DNA plasmid. Chu trình nhiệt của phản ứng clony-PCR tƣơng tự nhƣ trong phản ứng PCR chỉ thay nhiệt độ gắn mồi là 540C. Sản phẩm clony-PCR đƣợc kiểm tra trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X, nhuộm gel trong ethidium bromide 1% và chụp ảnh dƣới ánh sáng đèn cực tím.
2.2.2.7. Tách chiết plasmid
Sau khi kiểm tra sản phẩm clony-PCR tiến hành tách plasmid bằng bộ Kit AccuPrep Plasmid Extraction của hãng Bioneer. Các bƣớc tách chiết plasmid:
(1)Lấy dịch vi khuẩn li tâm 3000 vòng/phút trong 7 phút, bỏ dịch thu cặn. (2)Hòa cặn trong 250 l Resuspension Buffer for plasmid (Buffer 1), đảo nhẹ. (3)Bổ sung 250 l Lysis Buffer for plasmid (Buffer 2) vào ống trên, đảo nhẹ. (4)Bổ sung 350 l Neutralization Buffer for plasmid (Buffer 3), đảo nhẹ để
tránh kết tủa cục bộ.
(5)Li tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút. Hút dịch nổi cho chảy qua cột tinh sạch plasmid của hãng Bioneer.
(7)Bổ sung 500 l Denaturation Buffer for plasmid (Buffer D), li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột.
(8)Bổ sung 700 l Washing Buffer for plasmid (Buffer 4), li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột.
(9)Đặt cột sang ống 1,5 ml mới, cho 20 l H2O vào chính giữa cột, để ở nhiệt độ phòng khoảng 3 phút và li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Thu nhận plasmid.
Kiểm tra sản phẩm tách plasmid trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X, nhuộm gel trong ethidium bromide 1% và chụp ảnh dƣới ánh sáng đèn cực tím.
2.2.2.8. Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotit
Trình tự của gen đƣợc xác định trên máy đọc trình tự nucleotit tự động ABI PRISM® 3100 Advant Genetic Analyzer (Applied Biosystem) sử dụng bộ hoá chất sinh chuẩn BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing.
2.3.1. Phƣơng pháp xử lí số liệu
2.3.1.1. Phƣơng pháp thống kê bằng chƣơng trình Excel
Xác định giá trị trung bình, phƣơng sai, độ lệch chuẩn, sai số trung bình mẫu ... bằng chƣơng trình Excel trên máy vi tính theo Chu Văn Mẫn (2003) [].
2.3.1.2. Phƣơng pháp xử lý trình tự gen
Hiện nay, có nhiều phần mềm chuyên dụng để xử lý trình tự gen nhƣ: PC GEN, Clustal, DNAstar, Bioedit, Chromas… Trong các phầm mềm kể trên, DNAstar là hệ thống phần mềm tiện dụng nhất, đƣợc tạo ra bởi một nhóm các nhà khoa học Mỹ. Phần mềm này bao gồm nhiều chƣơng trình với các chức năng khác nhau dùng để phân tích, so sánh, nối ghép trình tự gen.
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ PHÂN ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, KÍCH THƢỚC, KHỐI LƢỢNG LƢỢNG
3.1.1. Đặc điểm hình thái, kích thƣớc, khối lƣợng của 6 giống đậu tƣơng
Hình thái và khối lƣợng hạt là một trong những đặc tính quan trọng đƣợc quan tâm trong công tác chọn tạo giống đậu tƣơng. Kết quả phân tích đặc điểm hình thái của 6 giống đậu tƣơng nghiên cứu theo các tính trạng hình dạng hạt, màu sắc hạt, màu sắc rốn hạt, kích thƣớc, khối lƣợng hạt đƣợc trình bày ở bảng 3.1.và hình 3.1.
Hình 3.1. Hình dạng hạt đậu tƣơng nghiên cứu
Bảng 3.1. Mầu sắc, khối lƣợng, kích thƣớc hạt đậu tƣơng nghiên cứu
ĐT 84 XTĐ BD
Giống Hình dạng hạt Màu sắc hạt Màu sắc rốn hạt Khối lƣợng 1000 hạt (g) Kích thƣớc hạt Dài (cm) Rộng (cm) XTĐ Ovan Xanh nhạt Trắng 94,3± 0,22 0,66±0,03 0,49±0,02 BD Ovan Vàng Đen 89,79± 0,44 0,65±0,04 0,43±0,03 KH Ovan Vàng Đen 172,9± 0,25 0,81± 0,01 0,65±0,01 LĐ Ovan Vàng nhạt Đen 156,39± 0,44 0,72±0,03 0,58±0,03 ĐT84 Ovan Vàng Nâu 178,44±0,4 0 0,87± 0,05 0,69± 0,03 VX93 Ovan Vàng Đen 163,71± 0.30 0,79± 0,01 0,61± 0,02
Hình 3.1 và bảng 3.1 cho thấy các giống đậu tƣơng đều có hình dạng ovan, màu sắc của vỏ hạt chủ yếu là màu vàng, nhƣng tùy từng giống mà màu vàng có độ đậm nhạt khác nhau, riêng có giống XTĐ có màu xanh nhạt. Màu sắc rốn hạt có màu trắng, và đen đây là một đặc tính quan trọng công tác giám định giống.
Khối lƣợng hạt của các giống đậu tƣơng khác nhau là khác nhau, khối lƣợng 1000 hạt phụ thuộc vào kích thƣớc và độ đồng đều của hạt. Kích thƣớc hạt lớn thì khối lƣợng 1000 hạt sẽ cao. Khối lƣợng hạt của các giống đậu tƣơng dao động từ 89,79g đến 178,44g cao nhất là ĐT84 và thấp nhất là BD.
- Có thể xếp theo thứ tự từ cao đến thấp về khối lƣợng 1000 hạt của các giống đậu tƣơng nhƣ sau: ĐT84 > KH > VX93 > LĐ> XTĐ > BD
- Chiều dài của các giống đậu tƣơng là khác nhau. Có thể sắp xếp chiều dài của các giống đậu tƣơng theo thứ tự từ cao đến thấp nhƣ sau:
ĐT84 > KH > VX93 >LĐ > XTĐ > BD - Chiều rộng của các giống đậu tƣơng đƣợc sắp xếp: ĐT84 > KH > VX93 > LĐ> XTĐ > BD.
3.1.2. Tỷ lệ thiệt hại
Phân tích ảnh hƣởng của hạn đến sự sinh trƣởng và phát triển của cây đậu tƣơng thông qua tính tỷ lệ cây héo và tỷ lệ cây chết, chúng tôi đã xác định đƣợc tỷ lệ thiệt hại do hạn gây ra ở cả 6 giống đậu tƣơng nghiên cứu (bảng 3.2 và hình 3.2). Theo dõi thí nghiệm cho thấy, ở 3 ngày sau khi xử lý hạn đã bắt đầu ảnh hƣởng tới cây đậu tƣơng 3 lá nhƣng mức độ thấp, một số lá bắt đầu héo. Sau 5 ngày và 7 ngày sau khi xử lý bởi hạn mức độ ảnh hƣởng đã tăng lên rõ rệt.
Bảng 3.2. Tỷ lệ thiệt hại của 6 giống đậu tƣơng ở giai đoạn cây non 3 lá (%)
STT Giống Tỷ lệ thiệt hại (%)
Hạn 3 ngày Hạn 5 ngày Hạn 7 ngày Hạn 9 ngày
1 HG 6,67 32,22 58,89 87,78 3 BD 3,33 16,67 47,78 76,67 9 LĐ 6,67 32,22 56,67 80,00 10 KH 1,11 15,56 51,11 70,00 15 ĐT84 7,78 35,56 61,11 91,11 16 VX93 6,67 31,11 56,67 85,56
Đặc biệt sau 9 ngày hạn tất cả các giống nghiên cứu đều bị héo lá, số lƣợng cây bị chết cũng tăng cao. Nhƣ vậy tỉ lệ thiệt hại của các giống đậu tƣơng tăng dần theo thời gian bị hạn và khác nhau giữa các giống đậu tƣơng. Các giống đậu tƣơng địa phƣơng nghiên cứu đều có tỉ lệ số cây chết và héo thấp hơn so với giống đối chứng. Giống có tỷ lệ thiệt hại cao nhất là ĐT84, dao động trong khoảng 7,78% (hạn 3 ngày) đến 91,11% (hạn 9 ngày) và thấp nhất là giống KH (hạn 3 ngày thiệt hại 1,11%; hạn 9 ngày thiệt hại 70,00%).
3.1.3. Chỉ số chịu hạn tƣơng đối
Tính chống chịu của cây trồng nói chung và khả năng chịu hạn nói riêng là tính trạng đa gen. Vì vậy, chúng tôi tiến hành phân tích các chỉ tiêu khác nhau nhƣ: tỷ lệ thiệt hại, tỷ lệ cây sống sót, khả năng giữ nƣớc của cây đậu tƣơng 3 lá sau khi xử lý bởi hạn ở các ngƣỡng thời gian 3, 5, 7, 9 ngày.
Hình 3.2. Đậu tƣơng trƣớc khi xử lí hạn
Hình 3.3. Đậu tƣơng sau khi xử lí hạn 9 ngày
Hình 3.4. Đậu tƣơng sau khi xử lí hạn 15 ngày
Khi bị hạn, lƣợng nƣớc trong tế bào giảm gây tổn thƣơng cho cây. Các giống cây khác nhau sẽ có những đáp ứng khác nhau để làm giảm hoặc tránh bị tổn thƣơng. Qua thí nghiệm cho thấy, 3 ngày sau khi xử lý hạn đã bắt đầu ảnh hƣởng tới cây đậu tƣơng 3 lá nhƣng mức độ rất thấp, sau 5 ngày xử lý hạn mức độ ảnh hƣởng đã tăng lên rõ rệt, đặc biệt sau 9 ngày, tất cả các giống đậu tƣơng nghiên cứu đều bị héo lá và số lƣợng cây bị chết cũng tăng lên cao. Giống SL có tỷ lệ cây sống và khả năng giữ nƣớc của cây là cao nhất và thấp nhất là giống ĐT84. Điều này chứng tỏ khả năng chịu hạn của các giống đậu tƣơng nghiên cứu ở mức độ cây non 3 lá là khác nhau. Kết quả xác định chỉ số chịu hạn tƣơng đối của các giống đậu tƣơng đƣợc trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Chỉ số chịu hạn tƣơng đối của các giống đậu tƣơng
STT Giống Chỉ số chịu hạn
tƣơng đối xử lí bởi hạn có tỷ Số ngày sau khi lệ 100% cây chết 1 XTĐ 26,12 12 2 BD 41,03 15 3 KH 40,17 15 4 LĐ 35,08 13 5 ĐT84 21,22 11 6 VX93 23,95 12
Từ kết quả ở bảng 3.3 chúng tôi thấy đƣợc chỉ số chịu hạn tƣơng đối của các giống đậu tƣơng nghiên cứu ở giai đoạn cây 3 lá là khác nhau, những giống có chỉ số chịu hạn tƣơng đối càng lớn thì sẽ có khả năng phản ứng với hạn càng cao
và ngƣợc lại. Bảng 3.3 cho thấy, giống BD có chỉ số chịu hạn cao nhất (41,03) và thấp nhất là giống ĐT84 và VX93 (21,22 và 23,95 ).
Kết quả này phù hợp với kết quả đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn hạt nảy mầm đã trình bày ở trên.
3.2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP GEN DREB5 TỪ CÂY ĐẬU TƢƠNG 3.2.1. Tách chiết RNA tổng số từ lá mầm của các giống đậu tƣơng
Mọi nghiên cứu về hệ gen đều bắt đầu từ việc tách chiết đƣợc DNA hoặc RNA ở dạng tinh sạch. Trên đối tƣợng đậu tƣơng hàm lƣợng protein cao nên việc tách đƣợc RNA tinh sạch sẽ gặp khó khăn hơn các đối tƣợng khác.
Mẫu RNA tổng số sau khi tách chiết đƣợc điện di trên gel argarose 1% và đƣợc chụp ảnh trên máy Wealtec Dolphin- Doc (Hình 3.5).
Hình 3.5. Ảnh điện di RNA tổng số trên gel agarose 1%.
Ghi chú :
M: chỉ thị phân tử DNA của thực khuẩn thể đƣợc cắt bằng HindIII. 1 : Xanh tiên đài
1 2 M
2 : ĐT84
Theo kết quả này băng của RNA có thể dùng để tạo cDNA rồi PCR để sử dụng cho các giai đoạn tiếp theo
3.2.2. Kết quả RT-PCR tạo DNA
Hình 3.6 Ảnh điện di DNA sản phẩm của RT-PCR
Ghi chú:
M: chỉ thị phân tử DNA của thực khuẩn thể đƣợc cắt bằng HindIII. 1 : Xanh tiên đài
2 : ĐT84
Kết quả ở hình 3.6 cho thấy cả 2 mẫu đều cho sản phẩm RT-PCR với kích thƣớc khoảng ~0,93kb, kích thƣớc này phù hợp theo tính toán lý thuyết và giống
M 1 2
sản phẩm DNA gen DREB5 của giống đậu tƣơng Trung quốc có trong ngân hàng gen là 0,927kb. Chính vì vậy chúng tôi sử dụng sản phẩm PCR này để biến nạp và tách dòng.
3.2.3. Kết quả dòng hóa sản phẩm gen DREB5 trong vector tách dòng
Sau khi thu nhận DNA thuộc gen DREB có trong đậu tƣơng bằng RT- PCR, chúng tôi tiến hành tách dòng gen. Tách dòng bằng cách chuyển nạp sản phẩm RT- PCR vào tế bào Ecoli chủng DH5- và tiến hành nuôi cấy trên môi trƣờng LB-agar có bổ sung Kanamycin và X-gal, để qua đêm.
kết quả thu đƣợc đƣợc thể hiện ở hình 3.7.
Hình 3.7: Đĩa nuôi cấy xuất hiện các khuẩn lạc trắng và khuẩn lạc xanh.
Chọn lọc các khuẩn lạc trắng nuôi cấy vào môi trƣờng LB lỏng, tốc độ lắc 200 vòng/phút ở 37oC qua đêm. Tế bào tái tổ hợp đƣợc thu lại bằng cách ly tâm và tách chiết DNA plasmid tái tổ hợp bằng bộ kít AccuPrep Plasmid Extraction của hãng Bioneer, kiểm tra sản phẩm DNA plasmid bằng enzym giới hạn EcoRI và điện di kiểm tra trên thạch agarose 1%. Kết quả tách dòng gen DRED5 và cắt kiểm tra bằng EcoRI đƣợc trình bày ở Hình 11.
Hình 3.8: Ảnh điện di sản phẩm tách plasmit đã cắt bằng enzym giới hạn EcoRI