4. Ý nghĩa khoa học
1.3. NGHIÊN CỨU NHÂN TỐ PHIÊN MÃ DREB
1.3.1. Gen DREB
DREB là họ gen tổng hợp protein đƣợc tìm thấy nhiều trong tế bào sống khi thực vật gặp các điều kiện bất lợi nhƣ hạn hán, mặn và lạnh. Nhiều công trình nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới cho rằng, DREB là nhân tố phiên mã tham gia tích cực vào quá trình này bằng cách kích hoạt nhanh sự hoạt động của các gen tham gia trực tiếp chống lại các điều kiên bất lợi của môi trƣờng nhƣ hạn hán, mặn và lạnh, nhƣng nhân tố phiên mã DREB hoạt động không cần thông qua sự tác động của ABA (Lê Thị Thu Hiền và cs) [5].
DREB đã đƣợc các nhà khoa học trên thế giới quan tâm và nghiên cứu từ những năm 80 của thế kỷ XX, tập trung vào các giống cây trồng nhƣ cây hoa cúc, lạc, hƣớng dƣơng… và đã thu đƣợc những thành quả nhất định cho khoa học trong việc cải thiện khả năng chống chịu của thực vật trƣớc điều kiện môi trƣờng
khắc nghiệt và biến đổi khí hậu nhƣ hiện nay. Các nhà khoa học Trung Quốc, Đức, Pháp, Mỹ… đã nghiên cứu và giải trình tự gen DREB trên loài cúc và hƣớng dƣơng, lúa mì; đã so sánh trình tự gen của các loài cây trồng và hoang dại thấy rằng có sự sai khác giữa chúng từ đó họ đã đề xuất phƣơng án cải thiện khả năng chống chịu thông qua việc cải tiến ở mức phân tử của cơ chế chống chịu điều kiện bất lợi của môi trƣờng sống đó là chuyển gen mục tiêu từ loài chống chịu tốt vào loài chống chịu kém.
Zhaoshi và cs (2008), phân tích chức năng của gen GmDREB3, trong đậu tƣơng (Glycine max L.), K. Shahrokhabadi và cs (2008), đã xác định các gen trong họ gen DREB ở cây đậu tƣơng, JG Dubouzet và cs (Nhật Bản) nghiên cứu chức năng gen DREB trên đối tƣợng là lúa, Dubouzet et al (2003) cho rằng gen OsDREB1A, OsDREB1B, OsDREB1C, OsDREB1D, gặp lạnh, OsDREB2A đƣợc biểu hiện khi mất nƣớc và nồng độ muối cao. Các OsDREB1A và OsDREB2A tạo protein liên quan đến yếu tố DRE và kích hoạt phiên mã của gen GUS tham gia vào quá trình chống chịu hạn . Theo Yang et al (2007) ông đã phân lập đƣợc phân họ DREB trên đối tƣợng hoa cúc, theo đó phân họ gồm DmDREBa và DmDREBb, những gen này mã hai cho hai protein có 191 amino acid và 185 amino acid với dự đoán trọng lƣợng phân tử của 21,66 và 20,99 kDa, các protein của 2 gen này đƣợc biểu hiện khi cây hoa cúc bị hạn lạnh. Theo Li et al (2005) phân lập gen trên đối tƣợng cây đậu tƣơng và đã chia thành các phân họ DREB gồm: GmDREBa, GmDREBb, GmDREBc, ngoài ra còn có DREB1, DREB2, DREB3, DREB4, DREB5, mỗi gen có trình tự, độ dài khác nhau nhƣng đều đƣợc biểu hiện nhiều khi đậu tƣơng gặp các điều kiện hạn.
Hình 1.1: Cơ chế biểu hiện của DREB1A khi lúa gặp hạn hán
Có thể nói việc nghiên cứu về DREB hiện nay đang là vấn đề thời sự bởi lẽ mặc dù DREB không trực tiếp tham gia vào quá trình chống chịu hạn nhƣng nó đã quyết định việc chống chịu có đạt hiệu quả hay không bằng cách kích hoạt đồng thời sự biểu hiện của gen chống chịu. Nghiên cứu DREB sẽ giúp cải thiện sự chống chịu của cây trồng đối với hạn thông qua việc chuyển gen.
1.3.2. Nghiên cứu về DREB5 bằng phƣơng pháp RT-PCR Phản ứng RT-PCR (PCR ngƣợc) Phản ứng RT-PCR (PCR ngƣợc)
Thực chất của RT-PCR là phản ứng nhân trình tự DNA từ khuôn RNA, gồm 2 giai đoạn:
(1)Tổng hợp trình tự DNA từ sợi RNA làm khuôn
(2) Trình tự DNA 2 sợi làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR
Phản ứng biến đổi RNA thành DNA phải nhờ enzyme phiên mã ngƣợc (Reverse-trancriptase) đƣợc gọi là giai đoạn chuyển ngƣợc (RT) thực hiện ở nhiệt độ 500
-550 trong 30 phút. Sau đó có sản phẩm DNA 2 sợi thì phản ứng tiếp theo là PCR thông thƣờng gồm 3 giai đoạn. RT-PCR đƣợc sử dụng để nhân RNA của retrovirus hoặc mRNA tách từ tế bào chất.
-Giai đoạn 2 (RT) 1 chu kì thực hiện sao chép ngƣợc từ RNA sợi đơn sang DNA sợi kép ở nhiệt độ 500-550C, trong 30 phút.
-Giai đoạn 2 (PCR): (1) Biến tính ở nhiệt độ 940-950C/1 phút. (2) Tiếp hợp mồi ở 400-650C.
(3) Tổng hợp DNA ở 720C/1 phút.
Cấu trúc mũ đầu 5'
AAA(A)n đuôi poly(A) đầu 3' mRNA
Cấu trúc mũ đầu 5'
AAA(A)n đuôi poly(A) đầu 3' Oligo(dT)12-18 primer 3'-OH 5'
dNTP Reverse transcriptase
AAA(A)n đuôi poly(A) đầu 3' Oligo(dT)12-18 primer 3'-OH 5'
5' 3'
cDNA : mRNA
Việc phân lập một gen nào đó thƣờng sử dụng phản ứng PCR, tuy nhiên PCR thu đƣợc sản phẩm chứa đoạn không mã hóa protein (intron), để không có đoạn intron ngƣời ta dùng phản ứng RT-PCR đi từ khuôn ban đầu là RNA.
Trên thế giới đặc biệt những nƣớc có nền khoa học phát triển mạnh nhƣ Mỹ, Đức, Nhật bản và hiện nay là Trung quốc đang có những quan tâm lớn đến vấn đề này, các nhà khoa học đang tìm lời giải hữu hiệu cho vấn đề hạn hán của cây trồng do trái đất đang nóng dần lên. Các công trình nghiên cứu về gen DREB ở cây trồng thông qua phản ứng RT-PCR tiêu biểu có thể kể đến Yanwen Xiong (2007) phân lập gen DREB1A trên đối tƣợng lúa, Stolf-Moreira et al (2009) đã phân lập thành công gen DREB1 và DREB2 trên đối tƣợng đậu tƣơng suy đoán các gen này mã hóa protein có khối lƣợng lần lƣợt là 24,2 và 37,7 kDa, Chen, M et al (2007) đã đọc trình tự thành công gen DREB5 trên đối tƣợng đậu tƣơng đây cũng là chuỗi gen DREB duy nhất công bố ở Genbank.
Ở Việt Nam vấn đề nghiên cứu DREB vẫn còn rất mới mẻ, chƣa có công trình nào công bố liên quan đến gen DREB chính vì vậy việc nghiên cứu gen DREB hiện nay là rất cần thiết tạo nguyên liệu cơ bản cho các nghiên cứu ứng dụng và chuyển gen ở cây đậu tƣơng.
Chƣơng 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1.VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.1.1. Vật liệu thực vật
Sử dụng 6 giống đậu tƣơng có chất lƣợng tốt do Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam và Viện Ngô Trung Ƣơng cung cấp có tên là: Xanh Tiên Đài, Bản Dốc, Khánh Hòa, Lâm Đồng và 2 giống đƣợc sử trồng nhiều ở miền Bắc là VX93 và ĐT-84 (bảng 2.1).
Bảng 2.1. Danh sách các giống đậu tƣơng nghiên cứu
STT Tên giống Kí hiệu Nguồn gốc Nơi cung cấp
1 Xanh Tiên Đài XTĐ Hà Giang Viện Ngô
2 Bản Dốc BD Cao Bằng Viện Ngô
3 Khánh Hòa KH Khánh Hòa Viện Ngô
4 Lâm Đồng LĐ Lâm Đồng Viện Ngô
5 ĐT 84 ĐT84 Viện KHNN Viện KHNN
6 VX 93 VX93 Viện KHNN Viện KHNN
2.1.2. Các hoá chất và thiết bị Hoá chất Hoá chất
Sử dụng các hoá chất thông dụng có nguồn gốc từ Anh, Đức, Trung Quốc và Thụy Điển nhƣ : Tris, glycin, toluen, agar, acetat natri, ethanol, NaCl, NaH2PO4, axit sunfosalysilic, axit axetic, iot, gelatin, Fe2(S04)3, K3Fe(CN)6, Na2C03, CuS04, C4H406KNa.4H20, axit ninhydrin...
Các hoá chất đƣợc mua của hãng Invitrogen: dNTP, Buffer, Taq DNA polymeraza, EDTA, TAE, TE, CTAB, TBE, SDS...
Thiết bị
Cân phân tích và cân điện tử (Đức, Thụy Sỹ), máy li tâm lạnh (Hettich, Đức), máy quang phổ UV - Visible spectrometer citra 40 (Úc), tủ sấy (Carbolite, Anh), tủ lạnh sâu, máy đo pH, buồng cấy vô trùng (Nuare, Mỹ), nồi khử trùng (ToMy, Nhật), máy soi chụp gel, máy PCR...
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phƣơng pháp sinh lý 2.2.1. Phƣơng pháp sinh lý
2.2.1.1. Đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non bằng phƣơng pháp gây hạn nhân tạo pháp gây hạn nhân tạo
Phƣơng pháp đánh giá nhanh khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non đƣợc xác định theo Lê Trần Bình (1998) [1].
- Hạt đậu tƣơng nảy mầm gieo vào các chậu (kích thƣớc 30cm x 30cm) chứa cát vàng đã rửa sạch, mỗi chậu trồng 30 cây, 3 chậu cho mỗi giống. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần trong điều kiện và chế độ chăm sóc nhƣ nhau. Thời gian đầu tƣới nƣớc cho đủ ẩm, khi cây đậu tƣơng đƣợc 3 lá tiến hành gây hạn nhân tạo và đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu tƣơng:
Chỉ số chịu hạn tƣơng đối (S) đƣợc xác định thông qua tỉ lệ sống sót (%), khả năng giữ nƣớc (%) của cây non trƣớc và sau hạn.
- Xác định tỷ lệ cây sống sót (%) đƣợc tính nhƣ sau:
- Xác định khả năng giữ nƣớc của cây đậu tƣơng 3 lá trong điều kiện hạn theo công thức:
Tỷ lệ cây sống sót =
Số cây sống
(%) Tổng số cây xử lý
fc ft W W W (%)
Trong đó: W(%): Khả năng giữ nước của cây sau khi xử lý hạn
Wft(g): Khối lượng tươi của cây sau khi xử lý hạn Wfc(g): Khối lượng tươi của cây không xử lý
- Tỷ lệ thiệt hại do hạn gây ra đƣợc tính theo công thức:
c N
b N
a ( 0 ) (%)
Trong đó: a: Tỷ lệ thiệt hại do hạn gây ra (%); b: Trị số thiệt hại của mỗi cấp;
c: Trị số thiệt hại của cấp cao nhất; N0: Số cây của mỗi cấp thiệt hại;
N: Tổng số cây xử lý.
Các trị số: Số cây chết: trị số 3; Số cây héo: trị số 1; Số cây không bị ảnh hƣởng: trị số 0.
- Chỉ số chịu hạn tƣơng đối đƣợc tính theo công thức:
S = sin ( ) 2 1 ga eg de cd bc ab
Trong đó: a: % cây sống sau 3 ngày hạn; b: % khả năng giữ nước sau 3 ngày hạn; c: % cây sống sau 5 ngày hạn; d: % khả năng giữ nước sau 5 ngày hạn; e: % cây sống sau 9 ngày hạn; g: % khả năng giữ nước sau 9 ngày hạn; α: góc tạo bởi 2 trục mang tri số gần nhau và tính bằng 360/x; S: chỉ số chịu hạn tương đối của các giống đậu tương.
2.2.2. Phƣơng pháp sinh học phân tử
2.2.2.1. Phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số
Phƣơng pháp tách RNA bằng AccuZol kit (Bioneer – Hàn Quốc) gồm các bƣớc sau:
- Chuẩn bị 100mg mẫu mầm hạt đậu tƣơng cho vào eppendorf 1.5ml. Dùng chày nhựa nghiền mẫu trong bình nitơ lỏng.
- Thêm 1ml của dung dịch AccuZol để tạo thành huyễn dịch đồng nhất. - Thêm 200 micrrolit Chloroform. Vortex vài giây. Ủ trong đá 5 phút. - Ly tâm 12.000 vòng phút trong 15 phút ở 4o
C.
- Chuẩn bị eppendorf mới để thu dịch nổi phía trên sau khi ly tâm. Chuyển pha nƣớc (dịch nổi phía trên) sang eppendorf mới và tính thể tích lƣợng dịch thu đƣợc bằng pipetman.
- Thêm Isopropal-2 với thể tích 1: 1 thể tích dịch thu đƣợc. Trộn hỗn hợp này bằng cách lắc đều (inverrting) 4 – 5 lần. Ủ hỗn hợp ở tủ lạnh -20oC thời gian 10 phút để tạo kết tủa RNA.
- Ly tâm 12.000 vòng phút/15 phút ở 4o
C.
- Đổ bỏ hỗn hợp nƣớc sau khi ly tâm, cẩn thận tránh làm mất RNA đã kết tủa ở đáy của eppendorf.
- Thêm 1ml cồn 80% để rửa tủa RNA. Vortex vài giây.
- Ly tâm 12.000 vòng phút trong 5 phút ở 4oC. Đổ bỏ nƣớc tránh làm mất RNA đã kết tủa’
- Làm khô RNA bằng cách mở nắp eppendorf trong box vô trùng khoảng 15 – 20 phút.
- Hòa tan RNA bằng nƣớc tinh khiết (nƣớc đã đƣợc ủ ấm trƣớc ở 60o
C trong 10 phút). Vortex để RNA hòa tan hoàn toàn. Tổng thể tích hòa tan một mẫu là 60μl nƣớc tinh khiết.
Điện di kiểm tra RNA của các mẫu thí nghiệm trên gel agarose 0,8% -1%. Sản phẩm điện di đƣợc nhuộm bằng ethidium bromide, soi và chụp ảnh dƣới ánh
sáng cực tím. Dựa vào hình ảnh điện di kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của RNA trong mẫu thí nghiệm đã tách chiết.
2.2.2.2. Kỹ thuật RT-PCR
Sau khi tách chiết và kiểm tra đƣợc độ tinh sạch của RNA tiến hành nhân gen DREB5 bằng kỹ thuật RT-PCR thực chất là PCR ngƣợc, gồm 2 giai đoạn chính là tạo cDNA và PCR với cặp mồi đặc hiệu.
Trình tự cặp mồi nhân gen DREB5 Mồi xuôi
DREBsoy5F: 5'-ATGCAATTCCCTCACCAATT-3' Mồi ngƣợc
DREBsoy5R: 5'-TCAATCCTGATCCTTCCACA-3'
Thành phần, chu kỳ nhiệt cho phản ứng RT-PCR đƣợc trình bày trong bảng 2.3 và bảng 2.4.
Bộ kit và hóa chất dùng cho phản ứng RT-PCR do hãng Invitrogen cung cấp.
Bảng 2.2: Thành phần hóa chất của phản ứng RT-PCR
Tên hóa chất Thể tích
Buffer 2x reaction mix 25,0 l
Enzym sao chép ngƣợc (RT) 1,0 l
Mồi xuôi (H5BAMF) (10pmol) 1,5 l
Mồi ngƣợc (H5NOTR) (10pmol) 1,5 l
Khuôn RNA 3,0 l
Nƣớc tinh khiết 18,0 l
Hỗn hợp phản ứng RT-PCR (Bảng 2.1) đƣợc trộn chung vào một ống PCR loại 0,2 ml sạch và đƣợc thực hiện trên máy PCR với chu kỳ nhiệt nhƣ bảng 2.2.
Bảng 2.3. Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR
Các bƣớc Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ
Bƣớc 1 42oC 60 phút 1 chu kỳ Bƣớc 2 95oC 15 phút 1 chu kỳ Bƣớc 3 94oC 1 phút 35 chu kỳ Bƣớc 4 55oC 1 phút Bƣớc 5 72oC 2 phút Bƣớc 6 72oC 10 phút 1 chu kỳ Bảo quản sản phẩm ở 4o C.
RT-PCR: (Reverse Transcriptase emzym sao chép ngƣợc) gồm:
Bƣớc 1: Ở 42oC là giai đoạn chuyển đổi RNA thành cDNA cho phản ứng PCR.
Bƣớc 2: Phản ứng PCR khuếch đại gen từ cDNA.
Sản phẩm RT-PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1% trong TAE 1X, với sự có mặt của marker chuẩn và chụp ảnh dƣới ánh sáng cực tím. Sau đó, sản phẩm đƣợc tinh sạch (thôi gel) theo bộ Kit DNA extraction Kit K05013 của hãng Fermentas.
Thành phần phản ứng PCR cho đọc trình trình tự gen Bảng 2.4: Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt PCR Thành phần phản ứng Chu trình nhiệt 96oC - 5 phút 96oC – 30 giây 50oC- 15 giây 30 chukỳ 68oC- 4 phút Cất giữ ở 4oC 2.2.2.3. Phƣơng pháp tinh sạch sản phẩm RT-PCR
- Điện di sản phẩm RT-PCR trên gel agarose 1% và cắt lấy băng quan tâm có kích thƣớc khoảng 927 bp cho vào ống eppendort 1,5 ml .
- Bổ sung 1000µl dung dịch Binding esdution.
- Ủ ở 550C trong khoảng 20 phút, 5 phút trộn nhẹ một lần cho gel tan hoàn toàn thành dịch trong suốt.
- Bổ sung 5 - 10µl Silica power vào và ủ sản phẩm ở 550C khoảng 5 phút rồi vontex khoảng 2 phút.
- Li tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút, loại dịch nổi, thu cặn màu trắng. - Bổ sung tiếp khoảng 500µl Buffer wash, vontex 2 phút. Li tâm 10000
vòng/phút trong 1 phút để loại dịch nổi, thu tủa (bƣớc này lặp lại 3 lần). Thành phần Thể tích (l) Mồi (1pmol) 3.2 l Nƣớc 3 l Khuôn DNA 2.8 l Big Dye 1 l Enhancer (1X) 10 l Tổng 20 l
- Làm khô DNA trong box.
- Hoà tan cDNA trong 20µl H2O deion khử trùng rồi ủ sản phẩm ở 550
C trong 5 - 10 phút.
- Li tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút để thu dịch nổi, bỏ tủa.
- Điện di kiểm tra sản phẩm thôi gel trên gel agarose 1%. Sản phẩm điện di đƣợc nhuộm bằng ethidium bromide, soi và chụp ảnh dƣới ánh sáng cực tím.
2.2.2.4. Phƣơng pháp gắn gen vào vector tách dòng
Sản phẩm PCR sau khi đƣợc tinh sạch sẽ đƣợc gắn trực tiếp vào vector tách dòng pCR®2.1-TOPO® với bộ Kit TOPO-TA cloning (Invitrogen) (Hình 2.1). Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng pCR®
2.1-TOPO® đƣợc thể hiện ở bảng 2.5.
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng pCR®
2.1-TOPO®
Tên hóa chất Thể tích (µl)
Buffer 10X 1
Vector pCR®2.1-TOPO® 1
Enzym T4-ligase 1
Nƣớc tinh khiết (khử ion) 4
cDNA sản phẩm RT-PCR 3
Tổng thể tích: 10
Hỗn hợp đƣợc ủ ở 220
C trong 1h, sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α
pCR®2.1-TOPO®
3931 nucleotides
Hình 2.1. Sơ đồ cấu tạo vector pCR®
2.1-TOPO® (Invitrogen)
2.2.2.5. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α
Bổ sung 7µl vector đã gắn gen vào ống đựng tế bào khả biến và trộn nhẹ. Đặt hỗn hợp vào đá trong 30 phút, rồi ủ ở 420C chính xác 1 phút. Sau đó tiếp tục đặt hỗn hợp vào đá 5 phút. Bổ sung 400µl môi trƣờng LB lỏng (pepton, cao nấm men, NaCl) vào hỗn hợp rồi đem hỗn hợp nuôi lắc 200 vòng/phút trong 1 giờ ở 370C. Sử dụng que cấy trải, trải 200µl dịch khuẩn lên đĩa môi trƣờng LB đặc (pepton, cao nấm men, NaCl, agarose) có chứa kháng sinh ampicillin (100mg/l),
khuẩn lạc có màu trắng nuôi trong môi trƣờng LB lỏng (có bổ sung ampicillin) qua đêm.