4. Ý nghĩa khoa học
2.2.2.1. Phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số
Phƣơng pháp tách RNA bằng AccuZol kit (Bioneer – Hàn Quốc) gồm các bƣớc sau:
- Chuẩn bị 100mg mẫu mầm hạt đậu tƣơng cho vào eppendorf 1.5ml. Dùng chày nhựa nghiền mẫu trong bình nitơ lỏng.
- Thêm 1ml của dung dịch AccuZol để tạo thành huyễn dịch đồng nhất. - Thêm 200 micrrolit Chloroform. Vortex vài giây. Ủ trong đá 5 phút. - Ly tâm 12.000 vòng phút trong 15 phút ở 4o
C.
- Chuẩn bị eppendorf mới để thu dịch nổi phía trên sau khi ly tâm. Chuyển pha nƣớc (dịch nổi phía trên) sang eppendorf mới và tính thể tích lƣợng dịch thu đƣợc bằng pipetman.
- Thêm Isopropal-2 với thể tích 1: 1 thể tích dịch thu đƣợc. Trộn hỗn hợp này bằng cách lắc đều (inverrting) 4 – 5 lần. Ủ hỗn hợp ở tủ lạnh -20oC thời gian 10 phút để tạo kết tủa RNA.
- Ly tâm 12.000 vòng phút/15 phút ở 4o
C.
- Đổ bỏ hỗn hợp nƣớc sau khi ly tâm, cẩn thận tránh làm mất RNA đã kết tủa ở đáy của eppendorf.
- Thêm 1ml cồn 80% để rửa tủa RNA. Vortex vài giây.
- Ly tâm 12.000 vòng phút trong 5 phút ở 4oC. Đổ bỏ nƣớc tránh làm mất RNA đã kết tủa’
- Làm khô RNA bằng cách mở nắp eppendorf trong box vô trùng khoảng 15 – 20 phút.
- Hòa tan RNA bằng nƣớc tinh khiết (nƣớc đã đƣợc ủ ấm trƣớc ở 60o
C trong 10 phút). Vortex để RNA hòa tan hoàn toàn. Tổng thể tích hòa tan một mẫu là 60μl nƣớc tinh khiết.
Điện di kiểm tra RNA của các mẫu thí nghiệm trên gel agarose 0,8% -1%. Sản phẩm điện di đƣợc nhuộm bằng ethidium bromide, soi và chụp ảnh dƣới ánh
sáng cực tím. Dựa vào hình ảnh điện di kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của RNA trong mẫu thí nghiệm đã tách chiết.