- Nguyên tắc
Dùng casein làm cơ chất, xác định hoạt tính phân giải protein của enzyme protease tren cơ sở định lƣợng sản phẩm tạo thành bằng phản ứng màu với thuốc thử. Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lƣợng tyrosine tƣơng ứng với lƣợng sản phẩm thủy phân dƣới tác dụng của enzyme protease.
- Hĩa chất
Dung dịch đệm phosphate - pH 7- 0,1M Dung dịch tyrosin chuẩn 1µmol/ml Dung dịch casein 1%
Thuốc thử folin (pha lỗng 5 lần) Dung dịch NaOH 0,5N
Dung dịch HCl 0,1M
- Cách tiến hành
Dựng đƣờng chuẩn tyrosin
Mẫu đối chứng: Lấy dung dịch HCl 0,1M thay cho dung dịch tyrosin và tiến hành nhƣ trên.
Xác định hoạt tính enzyme protease
Chúng ta sẽ hút 1ml dung dịch cơ chất casein vào ống nghiệm và đem ủ ở 370C trong 10-15 phút. Sau thời gian ủ, cho 1ml dung dịch enzyme đã đƣợc pha lỗng (10 lần) vào và lắc đều, rồi đem đi ủ ở 370C trong 60 phút. Sau đĩ cho vào hỗn hợp này 2ml dung dịch TCA, để ổn định dung dịch trong 25 phút, đem dung dịch đi lọc để loại tủa. Hút 1ml dịch lọc vào ống nghiệm khác và cho tiếp 5ml dung dịch Na2CO3 vào,
Số ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 Tyrosin ( ml ) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 HCl 0,1M ( ml ) 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 Na2CO3 0,4M ( ml ) 5 5 5 5 5 5 Thuốc thử folin (ml) 1 1 1 1 1 1
Lắc đều, để ổn định dung dịch trong 20 phút ở 370
C Đo hấp thụ của dung dịch ở bƣớc sĩng 660nm
thêm 1ml thuốc thử Folin, lắc đều, để yên ở 370C trong 20 phút. Khi dung dịch xuất hiện màu xanh thì đem đi đo quang ở bƣớc sĩng 660nm.
Mẫu đối chứng: Lấy 1ml nƣớc cất thay cho 1ml dung dịch enzyme và tiến hành nhƣ trên.
- Kết quả
Hoạt tính của enzyme protease đƣợc tính dựa vào định nghĩa: Một đơn vị hoạt tính enzyme protease đƣợc xác định là lƣợng enzyme để tạo ra lƣợng amino acid tƣơng đƣơng với 100µg Tyrosin trong 1ml dung dịch lọc dƣới điều kiện thí nghiệm.
Hoạt tính enzyme protease (DVHT/g) = (A – A0) * F * n * 1/100 A: Độ hấp thụ của mẫu
A0: Độ hấp thụ của mẫu đối chứng F: Lƣợng Tyrosin từ đƣờng chuẩn n: Hệ số pha lỗng c ủa enzyme