2.1.1 Nhuộm Gram
Nguyên tắc dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh và Iot mà hình thành nên hai loại phức chất khác nhau.
Loại phức chất thứ nhất vẫn giữ nguyên màu của thuốc nhuộm nên khơng bị rửa trơi khi xử lý bằng cồn. Vi sinh vật cĩ phức chất này thuộc loại Gram dƣơng. Loại phức chất thứ hai khơng cịn giữ đƣợc màu của thuốc nhuộm nên mất màu khi xử lý bằng cồn và bắt màu của thuốc nhuộm bổ sung. Vi sinh vật cĩ lo ại phức chất này thuộc Gram âm.
Cách tiến hành :
- Làm tiêu bản : Dùng que cấy lấy nƣớc cất vơ trùng làm vết bơi lên phiến kính (lấy một ít khuẩn lạc làm vết bơi). Để khơ vết bơi trong khơng khí hoặc cố định trên ngọn lửa đèn cồn.
- Nhuộm tiêu bản : Nhuộm tím kết tinh lên vết bơi để yên trong 1 phút. Sau đĩ rửa nƣớc và thấm khơ nhuộm lugol trong 1 phút. Sau đĩ rửa nƣớc và thấm khơ rửa vết bơi bằng cồn 96 trong 30 giây, r ửa nƣớc thấm khơ nhuộm với Fucshin trong 30 giây, rửa nƣớc thấm khơ vết bơi quan sát dƣới kính hiển vi ổ vật kính 100x
Đọc kết quả : Tế bào bắt màu hồng (Gram âm). Tế bào bắt mảu tím (Gram dƣơng).
2.1.2 Nhuộm bào tử
Sự hình thành bào tử là một hình thức đổi mới tế bào khi gặp những điều kiện bất lợi trong chu trình sống (nhiệt độ, áp suất, pH…).Nguyên tắc nhuộm dựa trên cấu trúc đặc biệt của màng bào tử (dày, chắc, khĩ bắt màu, chứa nhiều lipid). Trƣớc hết xử lý để tế bào chất của bào tử và tế bào bằng thuốc nhuộm cĩ hoạt tính mạnh. Sau đĩ tẩy màu tế bào chất của tế bào đi và nhuộm nĩ bằng một thuốc nhuộm khác bổ sung. Nhờ đĩ, tế bào chất của bào từ và tế bào chất của tế bào bắt màu phân biệt.
Phƣơng pháp nhuộm nhƣ sau: Làm vết bơi và cố định vết bơi tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp nhuộm Gram đã trình bày ở trên. Sau đĩ nhuộm vết bơi bằng malachite trong vịng 10 phút, r ửa nƣớc và thấm khơ nhuộm vết bơi bằng Fucshin trong 30 giây, rửa nƣớc thấm khơ quan sát dƣới kính hiển vi.
Đọc kết quả : Tế bào bắt màu hồng cịn bào tử bắt màu xanh lục.
2.1.3 Nhuộm vỏ nhày
Các bƣớc tiến hành nhƣ sau :
- Nhỏ vài giọt dung dịch tím kết tinh lên phiến kính
- Lấy một ít khuẩn lạc trộn đều tím kết tính đã cĩ sẵn trên phiến kính, dàn đều vết bơi, nhuộm trong vịng 5 – 7 phút rửa vết bơi bằng dung dịch CuSO4 20%, rửa nƣớc thấm khơ quan sát dƣới kính hiển vi
Đọc kết quả: Tế bào cĩ màu sẫm cịn vỏ nhày cĩ màu nhạt ở xung quanh.
2.2 Các phản ứng sinh hĩa xác định vi sinh vật 2.2.1 Thử nghiệm Catalase 2.2.1 Thử nghiệm Catalase
Nguyên tắc của thử nghiệm này nhằm xác định hiện diện của enzyme catalase c ủa vi sinh vật.
Cơ sở sinh hĩa nhƣ sau: enzyme catalase hiện diện trong hầu hết các vi sinh vật hiếu khí cĩ hệ thống cytochrom. Những vi sinh vật kỵ khí nhƣ Clostridium cĩ hệ thống peroxydase thay cho enzyme catalase. Tuy thế enzyme catalase hoạt động khơng chuyên biệt và chúng cĩ thể can thiệp vào hoạt động của enzyme peroxidase.
Phƣơng pháp tiến hành thử nghiệm: Hĩa chất sử dụng là H2O2 30%. Dùng que c ấy vịng lấy một ít sinh khối đ ặt lên lame, nhỏ một giọt H2O2 30% lên sinh khối vi sinh vật, ho ặc cĩ thể thử trong ống thạch nghiêng và đĩa petri mơi trƣờng đặc, tƣơng tự nhỏ 1 giọt H2O2 30% lên sinh khối của vi sinh vật.
Đọc kết quả: Thử nghiệm (+) khi cĩ hiện tƣợng sủi bọt khí, thử nghiệm (-) là khơng cĩ hiện tƣợng sủi bọt.
2.2.2 Thử nghiệm khả năng sinh Indol
Nguyên tắc: Phát hiện khả năng của vi khuẩn cĩ thể tạo Indol trong mơi trƣờng trypton. Các hợp chất trung gian trong quá trình thủy giải tryptophan là acid indolpyruvic, từ đĩ indol đƣợc hình thành thơng qua quá trình khử amin, hình thành skatol (metyl indol) là quá trình khử carboxyl cùa acid indol acetic. Enzyme tryptophan xúc tác phản ứng khử amin của tryptophan và tách nhân thơm ra khỏi phân tử tryptophan hình thành indol. Việc phát hiện indol đƣợc thực hiện bằng phản ứng giữa phân từ này với thuốc thử chứa p-dimethylaminobenzaldehyde (p-DMAB). Nhân pyrrol của indol chứa nhĩm –CH2 sẽ kết hợp với nhân benzen của p-DMAB tạo nên phức chất dạng quinone cĩ màu đỏ.
Cơ sở sinh hĩa của thử nghiệm nhƣ sau: Tryptophan là một aminoacid cĩ thể bị oxy hĩa bởi một số vi sinh vật cĩ hệ enzyme tryptophanase t ạo ra sản phẩm chứa gốc indol.
Phƣơng pháp tiến hành: Vi sinh vật thử nghiệm đƣợc nuơi trong mơi trƣờng canh trypton trong kho ảng 24 - 48 giờ, sau đĩ nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac’s hoặc thuốc thử Erhlich, quan sát màu vài phút.
Đọc kết quả: Thử nghiệm (+) khi trên bề mặt mơi trƣờng xuất hiện vịng đỏ cánh sen. Thử nghiệm (-) khi trên bề mặt mơi trƣờng khơng xuất hiện vịng đỏ.
2.2.3 Thử nghiệm Metyl Red
Nguyên tắc: Nhằm xác định khả năng c ủa vi sinh vật sản xuất và duy trì các s ản phẩm acid bên trong mơi trƣờng trong quá trình lên men glucose. Cơ sở sinh hĩa :thử nghiệm Metyl red dựa trên cơ sở sử dụng chất chỉ thị pH là metyl red để nhận biết lƣợng ion H+ cĩ trong mơi trƣờng sau khi vi sinh vật lên men glucose. Hàm lƣợng hai chất này lại tùy thuộc vào con đƣờng chuyển hĩa của từng loại vi sinh vật. Đối với các vi sinh vật đƣờng ruột, thời gian nuơi c ấy từ 18 – 24 giờ, các vi sinh vật này đều
tạo acid trong mơi trƣờng khi chúng bắt đ ầu phát triển. Đối với các vi sinh vật cho phản ứng Metyl red âm tính thì ngay ban đầu một lƣợng acid hình thành trong mơi trƣờng nhƣng kéo dài thời gian nuơi cấy chuyển hĩa các sản phẩm acid này thành acetoin do đĩ làm pH mơi trƣờng trung tính.
Phƣơng pháp tiến hành: Nuơi cấy vi sinh vật trong mơi trƣờng MRPV, ủ trong khoảng 2 – 5 ngày, sau đĩ nhỏ vài giọt thuốc thử metyl red đƣợc pha theo tỷ lệ 0.1g trong 300ml cồn và cho vào nƣớc định mức 500ml.
Đọc kết quả : thử nghiệm (+) khi mơi trƣờng chuyển sang màu đỏ. Thử nghiệm (-) khi mơi trƣờng khơng đổi màu.
2.2.4 Thử nghiệm Voges-Proskauer
Nguyên tắc: Phát hiện khả năng vi sinh vật tạo thành một số sản phẩm trung tính acetoin trong quá trình lên men glucose.
Cơ sở sinh hĩa: Thử nghiệm này nhằm mục đích phát hiện acetoin, một sản phẩm trung tính trong quá trình trao đổi glucose trong tế bào vi sinh vật. Ở tế bào vi sinh vật, sự phân hủy glucose tạo ra sản phẩm trung gian là acid pyruvic, t ừ đĩ cĩ thể chia vi sinh vật thành 2 nhĩm theo con đƣờng chuyển hĩa pyruvic khác nhau : nhĩm trao đổi khơng tạo thành 2,3-butanediol nhƣ E.coli thử nghiệm (-) ; và nhĩm tạo 2,3- butanediol nhƣ Klebsiella thử nghiệm (+). Tuy nhiên thử nghiệm này nhằm xác định acetoin – tiền chất của 2,3-butanediol, vì là tiền chất nên quá trình nuơi cấy tích lũy rất ít, để dễ dàng phát hiện quá trình nuơi cấy thử nghiệm đƣợc tiến hành trong điều kiện hiếu khí, sau đĩ phát hiện acetoin trong mơi trƣờng bằng thuốc thử α- naphtol trong mơi trƣờng kiềm mạnh đƣợc tạo ra bằng KOH 40%.
Phƣơng pháp tiến hành: Nuơi cấy vi sinh vật trong mơi trƣờng MRPV ủ ở nhiệt độ 370C trong 2 – 5 ngày, sau đĩ nhỏ 2 giọt KOH 40% và 6 giọt α-naphtol rồi quan sát sự xuất hiện màu.
Đọc kết quả : thử nghiệm (+) khi xuất hiện màu đỏ trên bề mặt mơi trƣờng. Thử nghiệm (-) khi mơi trƣờng khơng đổi màu.
2.2.5 Thử nghiệm Citrate
Nguyên tắc: Nhằm xác định vi si sinh vật sử dụng citrate nhƣ nguồn carbon duy nhất
Cơ sở sinh hĩa: Năng lƣợng cung cấp cho vi sinh vật khi trong mơi trƣờng khơng cĩ nguồn nguyên liệu để sử dụng cho quá trình lên men hay tạo các sản phẩm lactic bằng cách sử dụng nguồn carbon duy nhất là citrate.
Bƣớc đầu tiên vi sinh vật tách citrate thành oxaloacetate và acetate, đây là hai s ản phẩm trung gian cho quá trình đồng hĩa citrate, cịn s ản phẩm nhận đƣợc của quá trình này phụ thuộc vào pH của mơi trƣờng. Nếu pH kiềm thì trong mơi trƣờng sẽ nhận đƣợc nhiều acetate và fomate, nếu pH acid thì sản phẩm tạo ra là lactatte, acetoin.
Nhƣ vậy sự biến dƣỡng citrate bởi vi sinh vật sẽ tạo ra CO2 làm kiềm hĩa mơi trƣờng. Mặt khác các vi sinh vật cĩ khả năng sử dụng citrate nhƣ là nguồn carbon duy nhất thì cĩ khả năng sử dụng muối amonium nhƣ là nguồn đạm duy nhất sinh ra NH3 làm kiềm hĩa mơi trƣờng.
Trong mơi trƣờng thử nghiệm khả năng sử dụng citrate nhƣ là nguồn carbon duy nhất cĩ chứa đạm ở dạng muối amonium sẽ làm tăng pH của mơi trƣờng thể hiện qua sự đổi màu c ủa chỉ thị pH trong mơi trƣờng.
Phƣơng pháp tiến hành: Mơi trƣờng sử dụng trong thử nghiệm là Simmon citrate agar hay mơi trƣờng lỏng Koser. Cấy vi sinh vật lên mơi trƣờng thạch nghiêng Simmon citrate agar và ủ ở 370C trong 24 giờ lấy ra quán sát.
Đọc kết quả: Thử nghiệm (+) khi mơi trƣờng chuyển từ màu xanh lá cây sang xanh dƣơng. Thử nghiệm (-) là mơi trƣờng khơng đổi màu.
2.2.6 Thử nghiệm trên mơi trƣờng KIA/TSI
Nguyên tắc: Thử nghiệm này nhằm xác định khả năng vi sinh vật sử dụng các nguồn carbonhydrat cĩ mặt trong mơi trƣờng, khả năng sinh H2S, khả năng sinh gas.
Cơ sở sinh hĩa: Mơi trƣờng KIA là mơi trƣờng rắn chứa lactose 1%, glucose 1%, TSI tƣơng tự nhƣng chứa thêm sucrose 1%. Cĩ 3 trƣờng hợp xảy ra khi nuơi cấy vi sinh vật trên mơi trƣờng KIA :
- Chỉ lên men glucose, lên men c ả hai loại đƣờng và khơng lên men cả hai nguồn trên. Nếu vi sinh vật chỉ sử dụng glucose sau 24 giờ nuơi cấy làm phần nghiêng cĩ pH kiềm vì sau khi sử dụng hết lƣợng glucose thì vi sinh vật sử dụng pepton trong mơi trƣờng làm giải phĩng NH3 nên mơi trƣờng phần nghiêng cĩ pH kiềm, ở phần sâu mơi trƣờng cĩ sự lên men kỵ khí glucose các sản phẩm thu đƣợc là acid hữu cơ làm mơi trƣờng pH acid do trong mơi trƣờng cĩ chứa chất chỉ thị pH (thƣờng là phenol red) thì phần nghiêng của mơi trƣờng sẽ cĩ màu đỏ và phần sâu cĩ màu vàng.
- Nếu vi sinh vật sử dụng cà hai nguồn đƣờng nên phần nghiêng và sâu đều cĩ tính acid nên cả mơi trƣờng màu vàng.
- Trong trƣờng hợp cả hai nguồn carbon khơng đƣợc sử dụng thì nguồn pepton đƣợc sử dụng và làm mơi trƣờng pH kiềm nên cả mơi trƣờng cĩ màu đỏ.
Trong mơi trƣờng nếu cĩ tạo thành H2S thì mơi trƣờng cĩ màu đen , cĩ sinh gas thì gas sẽ tích tụ làm vỡ thạch hoặc tạo thành các bọt khí bên trong.
Đối với mơi trƣờng TSI thì các phản ứng xảy ra tƣơng tự, tuy nhiên trong trƣờng hợp cả phần nghiêng và phần sâu cĩ hiện tƣợng acid là do một trong hai hoặc cả hai nguồn sucrose và lactose đƣợc sử dụng. Trong trƣờng hợp này c ần làm thêm các thử nghiệm trên mơi trƣờng lactose và sucrose.
Đọc kết quả: Mơi trƣờng phần nghiêng màu đỏ, phần sâu màu vàng sử dụng glucose; phần nghiêng và phần sâu màu vàng khơng sử dụng các nguồn đƣờng trên; phần nghiêng và sâu màu vàng sử dụng các nguồn đƣờng trên.
2.2.7 Thử nghiệm tính di động trên mơi trƣờng thạch mềm
Nguyên tắc: Nhằm xác định vi sinh vật cĩ khả năng di động hay khơng.
Phƣơng pháp tiến hành: Cấy đâm sâu vi sinh vật trong mơi trƣờng cĩ bổ sung 0.5 – 0.6% agar, ủ ở 370C sau 24 – 48 giờ sau đĩ quan sát.
Đọc kết quả: Thử nghiệm (+) khi vi sinh vật mọc lan ra đƣờng cấy và làm đục mơi trƣờng xung quang. Thử nghiệm (-) khi vi sinh vật chỉ mọc dọc theo đƣờng cấy và mơi trƣờng vẫn trong.
2.2.8 Thử nghiệm Urease
Nguyên tắc: Nhằm xác định vi sinh vật cĩ khả năng phân hủy urea thành amonia và CO2 dƣới sự xúc tác của enzyme urease do vi sinh vật tiết ra.
Cơ sở sinh hĩa: urea là một hợp chất carbamide rất dễ thủy giải, sự thủy giải của urea dƣới sự xúc tác c ủa urease sẽ giải phĩng hai phân tử ammonia. Khi cĩ cơ chất urea hiện diện trong mơi trƣờng, urease đƣợc tổng hợp và phĩng thích ra mơi trƣờng bên ngồi tế bào xúc tác phản ứng thủy giải urea. Các sản phẩm sau phản ứng làm mơi trƣờng hĩa kiềm và làm chuyển màu chất chỉ thị pH
Phƣơng pháp tiến hành: Cấy vi sinh vật vào mơi trƣờng urea cĩ chứa chất chỉ thị là phenol red ủ ở 370C trong 12 – 18 giờ, sau đĩ quan sát sự đổi màu.
Đọc kết quả: Thử nghiệm (+) khi mơi trƣờng chuyển sang màu dỏ hồng. Thử nghiệm (-) khi mơi trƣờng khơng đổi màu.
2.3 Phƣơng pháp phân l ập giống Bacillus subtilis và xác định ho ạt tính enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis. của vi khuẩn Bacillus subtilis.
2.3.1 Phân lập giống
Giống Bacillus subtilis đƣợc phân lập từ nguồn natto của Nhật Bản và cỏ khơ. Mẫu đƣợc cắt nhỏ cho vào bình tam giác, cho nƣớc máy vào bình, đem đi đun sơi khoảng 15 phút. Sau đĩ đem đi ủ ở 370C trong vịng 48 giờ.
Sau 48 giờ, ta sẽ thấy một lớp váng xám, nhăn xuất hiện trên bề mặt. Ta sẽ đem đi pha lỗng đến độ pha lỗng thích hợp, rồi cấy trang ra đĩa petri, đem ủ ở 370
C trong 24 giờ để tạo ra các khuẩn lạc Bacillus subtilis riêng rẽ. Sau khi tạo đƣợc các khuẩn lạc riêng rẽ phải kiểm tra lại độ thuần của giống bằng cách pha giống với nƣớc muối sinh lý dùng kỹ thuật cấy ria sau đĩ quan sát sự thuần khiết của khuẩn lạc cũng chính là sự thuần khiết của giống. Kiểm tra và chọn khuẩn lạc tốt đem đi cấy truyền vào ống thạch nghiêng để giữ giống.
2.3.2 Xác định hoạt tính enzyme protease
- Nguyên tắc
Dùng casein làm cơ chất, xác định hoạt tính phân giải protein của enzyme protease tren cơ sở định lƣợng sản phẩm tạo thành bằng phản ứng màu với thuốc thử. Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lƣợng tyrosine tƣơng ứng với lƣợng sản phẩm thủy phân dƣới tác dụng của enzyme protease.
- Hĩa chất
Dung dịch đệm phosphate - pH 7- 0,1M Dung dịch tyrosin chuẩn 1µmol/ml Dung dịch casein 1%
Thuốc thử folin (pha lỗng 5 lần) Dung dịch NaOH 0,5N
Dung dịch HCl 0,1M
- Cách tiến hành
Dựng đƣờng chuẩn tyrosin
Mẫu đối chứng: Lấy dung dịch HCl 0,1M thay cho dung dịch tyrosin và tiến hành nhƣ trên.
Xác định hoạt tính enzyme protease
Chúng ta sẽ hút 1ml dung dịch cơ chất casein vào ống nghiệm và đem ủ ở 370C trong 10-15 phút. Sau thời gian ủ, cho 1ml dung dịch enzyme đã đƣợc pha lỗng (10 lần) vào và lắc đều, rồi đem đi ủ ở 370C trong 60 phút. Sau đĩ cho vào hỗn hợp này 2ml dung dịch TCA, để ổn định dung dịch trong 25 phút, đem dung dịch đi lọc để loại tủa. Hút 1ml dịch lọc vào ống nghiệm khác và cho tiếp 5ml dung dịch Na2CO3 vào,
Số ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 Tyrosin ( ml ) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 HCl 0,1M ( ml ) 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 Na2CO3 0,4M ( ml ) 5 5 5 5 5 5 Thuốc thử folin (ml) 1 1 1 1 1 1
Lắc đều, để ổn định dung dịch trong 20 phút ở 370
C Đo hấp thụ của dung dịch ở bƣớc sĩng 660nm
thêm 1ml thuốc thử Folin, lắc đều, để yên ở 370C trong 20 phút. Khi dung dịch xuất hiện màu xanh thì đem đi đo quang ở bƣớc sĩng 660nm.
Mẫu đối chứng: Lấy 1ml nƣớc cất thay cho 1ml dung dịch enzyme và tiến hành nhƣ trên.
- Kết quả
Hoạt tính của enzyme protease đƣợc tính dựa vào định nghĩa: Một đơn vị hoạt tính enzyme protease đƣợc xác định là lƣợng enzyme để tạo ra lƣợng amino acid tƣơng đƣơng với 100µg Tyrosin trong 1ml dung dịch lọc dƣới điều kiện thí nghiệm.
Hoạt tính enzyme protease (DVHT/g) = (A – A0) * F * n * 1/100 A: Độ hấp thụ của mẫu
A0: Độ hấp thụ của mẫu đối chứng F: Lƣợng Tyrosin từ đƣờng chuẩn n: Hệ số pha lỗng c ủa enzyme
2.3.3 Xác định hoạt tính enzyme amylase
- Nguyên tắc