- Nguyên tắc:
Hàm lƣợng protein thơ đƣợc tính gián tiếp bằng cách xác định hàm lƣợng nitơ tổng.
Trƣớc tiên vơ cơ hĩa mẫu bằng H2SO4 đậm đ ặc ở nhiệt độ cao với chất xúc tác. Các phản ứng của quá trình vơ cơ hĩa xảy ra nhƣ sau:
2H2SO4 → 2H2O +2SO2↑+ O2
Oxi tạo thành trong phản ứng lại oxi hĩa các nguyên tố khác. Các phân tử chứa nitơ dƣới tác dụng của H2SO4 tạo thành NH3. Ví dụ các protein bị thủy phân thành acid amine; carbon và hidro c ủa acid amine tạo thành CO2 và H2O; cịn nitơ đƣợc giải phĩng dƣới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 dƣ tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch: 2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4.
Các nguyên tố P, K, Ca, Mg,... chuyển thành dạng oxide: P2O5, K2O, CaO, MgO,... Giai đoạn chƣng cất giải phĩng NH3 : tạo mơi trƣờng kiềm đuổi nitơ ra khỏi dung dịch dƣới dạng NH3.
( NH4 )2SO4 Na2SO4 + NH3 + H2O
NH3 bay ra đƣợc làm lạnh biến đổi thành NH4OH rơi vào bình hứng, bình hứng chứa H2SO4 0.1N.
2NH4OH + H2SO4 → (NH4)2SO4 + 2H2O + H2SO4 dƣ Chuẩn độ H2SO4 dƣ bằng NaOH 0.1N
- Hĩa chất H2SO4 đậm đặc NaOH 40% H2SO4 0.1N chuẩn NaOH 0.1N chuẩn Thuốc thử Tasiro Chất xúc tác: hỗn hợp K2SO4 : CuSO4 (3:1) - Tiến hành Vơ cơ hĩa mẫu
Hút 1ml nƣớc mắm cho vào bình Kjeldahl, cho tiếp 5ml H2SO4 đậm đ ặc sẽ thấy xuất hiện màu nâu đen (do nguyên liệu đã bị oxi hĩa). Cho thêm chất xúc tác, lắc nhẹ, đậy kín để khoảng 3 phút. Đặt bình Kjeldahl lên bếp đun, đậy miệng bình bằng một phễu thủy tinh
Trong khi đun, theo dõi sự mất màu đen của dung dịch trong bình đun, khi thấy dung dịch gần nhƣ trong suốt thì cĩ thể lắc nhẹ bình để kéo hết các phân tử ở trên thành bình cịn chƣa bị oxi hố vào trong dung dịch. Tiếp tục đun cho đến khi dung dịch trong hồn tồn. Để nguội bình rồi chuyển tồn bộ dung dịch sang bình định mức 100 ml, dùng nƣớc cất vơ đạm tráng lại bình Kjeldahl và định mức đến vạch.
Cất đ ạm
Chuyển 50ml dung dịch trong bình định mức ở trên vào bình cất đạm cĩ sẵn 50ml nƣớc cất và 3 giọt thuốc thử Tashiro lúc này trong bình cĩ màu tím hồng. Tiếp tục cho vào bình c ất 15ml NaOH 40% cho đến khi tồn bộ dung dịch chuyển sang màu xanh lá mạ (thêm 5ml NaOH 40% nếu dung dịch trong bình chƣa chuyển hết sang màu xanh lá mạ).
Tiến hành lắp hệ thống cất đạm, cho vào bình hứng 20ml H2SO4 0.1N và 3 giọt thuốc thử Tashiro (dung dịch cĩ màu tím hồng). Đặt bình hứng sao cho ngập đ ầu ống sinh hàn. Bật cơng tắc cất đạm
Sau khi cất đ ạm 10-12 phút để kiểm tra xem NH4OH cịn đƣợc tạo ra khơng, dùng giấy qùy thử ở đầu ống sinh hàn. Nếu giấy qùy khơng đổi sang màu xanh là đƣợc. Ngƣng cất đạm, đợi hệ thống nguội mới tháo hệ thống đem đi rửa.
- Chuẩn độ:
Chuẩn độ H2SO4 dƣ trong bình hứng bằng NaOH 0.1N cho đến khi mất màu tím hồng và chuyển sang màu xanh lá mạ. Ghi nhận thể tích NaOH 0.1 N sử dụng.
- Tính kết quả
Hàm lƣợng % nitơ tổng số đƣợc tính theo cơng thức
N (mg%) = {1,42 * (V1-V2)*100/a}*2 V1: số ml H2SO4 cho vào bình hứng
V2: số ml NaOH 0.1N đã chuẩn độ a số miligam nguyên liệu
1,42 hệ số ; cứ 1 ml H2SO4 dùng để trung hịa NH4OH thì tƣơng đƣơng với 1,42mg Nitơ