Nhân giống trên mơi trƣờng dịch sữa đậu nành bổ sung thêm các chất khống. Thành phần mơi trƣờng nhân giống nhƣ sau:
- Dịch sữa đ ậu nành 100ml - Sacharose 3% - K2HPO4 0,1% - MgSO4 0,1% - NH4NO3 0,1% - NaCl 0,5% 2.5 Giữ giống
Mơi trƣờng giữ giống là mơi trƣờng cao thịt-peptone. Thành phần mơi trƣờng nhƣ sau: - Peptone 1g - Meat extract 1g - NaCl 0,5g - Argar 2g - Nƣớc 100ml
Hoặc cũng cĩ thể giữ giống trên mơi trƣờng nƣớc chiết đậu Thành phần mơi trƣờng nhƣ sau
- Agar 3g
- NaCl 0,5g Giữ giống bằng các phƣơng pháp
2.3.1 Phƣơng pháp cấy chuyền
Sau khi giống đã mọc tốt, ta c ần bảo quản ở nhiệt độ lạnh 3 - 4 0C và sau đĩ cấy truyền định kỳ trên mơi trƣờng thạch nghiêng mới.
Đây là phƣơng pháp phổ biến nhất dễ thực hiện bằng cách giữ giống trên mơi trƣờng thạch với thành phần mơi trƣờng nuơi cấy và điều kiện nuơi cấy thích hợp. Để kéo dài thời gian bảo quản giống, ta nên phủ 1 lớp parafin trên bề mặt giống để hạn chế sự phát triển của nĩ.
2.3.2 Bảo quản lạnh
Giữ giống ở nhiệt độ 2-50C trong tủ lạnh.
2.6 Các phƣơng pháp xác định chỉ tiêu hĩa sinh
2.6.1 Xác định độ ẩm
- Nguyên tắc:
Dùng sức nĩng làm bay hết nƣớc tự do cĩ trong thực phẩm. Cân trọng lƣợng trƣớc và sau khi sấy khơ, từ đĩ tính ra phần trăm nƣớc trong thực phẩm.
- Cách tiến hành: Cân đĩa petri đã sấy khơ
Cân 10g mẫu đã chuẩn bị sẵn, cho vào đĩa petri
Cho tất cả vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 100 – 1050C, sấy khơ cho đến trọng lƣợng khơng đổi ( thƣờng là khoảng 6h ).
Cho lại vào tủ sấy trong 30 phút, đem ra để nguội trong bình hút ẩm, cân lại cho đến khi trọng lƣợng mẫu khơng đổi. Kết quả giữa 2 lần cân liên tiếp khơng đƣợc cách nhau quá 0,5g.
- Tính kết quả:
Độ ẩm = ( trọng lƣợng mẫu khơ * 100 ) / trọng lƣợng mẫu tƣơi
2.6.2 Phƣơng pháp xác định đạm tổng số
- Nguyên tắc:
Hàm lƣợng protein thơ đƣợc tính gián tiếp bằng cách xác định hàm lƣợng nitơ tổng.
Trƣớc tiên vơ cơ hĩa mẫu bằng H2SO4 đậm đ ặc ở nhiệt độ cao với chất xúc tác. Các phản ứng của quá trình vơ cơ hĩa xảy ra nhƣ sau:
2H2SO4 → 2H2O +2SO2↑+ O2
Oxi tạo thành trong phản ứng lại oxi hĩa các nguyên tố khác. Các phân tử chứa nitơ dƣới tác dụng của H2SO4 tạo thành NH3. Ví dụ các protein bị thủy phân thành acid amine; carbon và hidro c ủa acid amine tạo thành CO2 và H2O; cịn nitơ đƣợc giải phĩng dƣới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 dƣ tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch: 2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4.
Các nguyên tố P, K, Ca, Mg,... chuyển thành dạng oxide: P2O5, K2O, CaO, MgO,... Giai đoạn chƣng cất giải phĩng NH3 : tạo mơi trƣờng kiềm đuổi nitơ ra khỏi dung dịch dƣới dạng NH3.
( NH4 )2SO4 Na2SO4 + NH3 + H2O
NH3 bay ra đƣợc làm lạnh biến đổi thành NH4OH rơi vào bình hứng, bình hứng chứa H2SO4 0.1N.
2NH4OH + H2SO4 → (NH4)2SO4 + 2H2O + H2SO4 dƣ
Chuẩn độ H2SO4 dƣ bằng NaOH 0.1N
- Hĩa chất H2SO4 đậm đặc NaOH 40% H2SO4 0.1N chuẩn NaOH 0.1N chuẩn Thuốc thử Tasiro Chất xúc tác: hỗn hợp K2SO4 : CuSO4 (3:1) - Tiến hành Vơ cơ hĩa mẫu
Hút 1ml nƣớc mắm cho vào bình Kjeldahl, cho tiếp 5ml H2SO4 đậm đ ặc sẽ thấy xuất hiện màu nâu đen (do nguyên liệu đã bị oxi hĩa). Cho thêm chất xúc tác, lắc nhẹ, đậy kín để khoảng 3 phút. Đặt bình Kjeldahl lên bếp đun, đậy miệng bình bằng một phễu thủy tinh
Trong khi đun, theo dõi sự mất màu đen của dung dịch trong bình đun, khi thấy dung dịch gần nhƣ trong suốt thì cĩ thể lắc nhẹ bình để kéo hết các phân tử ở trên thành bình cịn chƣa bị oxi hố vào trong dung dịch. Tiếp tục đun cho đến khi dung dịch trong hồn tồn. Để nguội bình rồi chuyển tồn bộ dung dịch sang bình định mức 100 ml, dùng nƣớc cất vơ đạm tráng lại bình Kjeldahl và định mức đến vạch.
Cất đ ạm
Chuyển 50ml dung dịch trong bình định mức ở trên vào bình cất đạm cĩ sẵn 50ml nƣớc cất và 3 giọt thuốc thử Tashiro lúc này trong bình cĩ màu tím hồng. Tiếp tục cho vào bình c ất 15ml NaOH 40% cho đến khi tồn bộ dung dịch chuyển sang màu xanh lá mạ (thêm 5ml NaOH 40% nếu dung dịch trong bình chƣa chuyển hết sang màu xanh lá mạ).
Tiến hành lắp hệ thống cất đạm, cho vào bình hứng 20ml H2SO4 0.1N và 3 giọt thuốc thử Tashiro (dung dịch cĩ màu tím hồng). Đặt bình hứng sao cho ngập đ ầu ống sinh hàn. Bật cơng tắc cất đạm
Sau khi cất đ ạm 10-12 phút để kiểm tra xem NH4OH cịn đƣợc tạo ra khơng, dùng giấy qùy thử ở đầu ống sinh hàn. Nếu giấy qùy khơng đổi sang màu xanh là đƣợc. Ngƣng cất đạm, đợi hệ thống nguội mới tháo hệ thống đem đi rửa.
- Chuẩn độ:
Chuẩn độ H2SO4 dƣ trong bình hứng bằng NaOH 0.1N cho đến khi mất màu tím hồng và chuyển sang màu xanh lá mạ. Ghi nhận thể tích NaOH 0.1 N sử dụng.
- Tính kết quả
Hàm lƣợng % nitơ tổng số đƣợc tính theo cơng thức
N (mg%) = {1,42 * (V1-V2)*100/a}*2 V1: số ml H2SO4 cho vào bình hứng
V2: số ml NaOH 0.1N đã chuẩn độ a số miligam nguyên liệu
1,42 hệ số ; cứ 1 ml H2SO4 dùng để trung hịa NH4OH thì tƣơng đƣơng với 1,42mg Nitơ
2.6.3 Định lƣợng nitơ acid amin bằng phƣơng pháp chuẩn độ formol
- Nguyên tắc
Các acid amin trong dung dịch nƣớc thì trung tính, khơng những do hai nhĩm chức acid -COOH và amin –NH2 trung hịa lẫn nhau, mà do cả hai nhĩm chức ấy đều yếu, quá trình điện ly rất kém. Khi gặp formol, nhĩm – NH2=CH2 mất tính chất kiềm, do đĩ tính chất acid của nhĩm –COOH nỗi bật lên và cĩ thể định lƣợng bằng NaOH với phenolphtalein làm chất chỉ thị màu.
R-CH-COOH + OCH2 → R-CH-COOH +H2O l l
NH2 N=CH2
Muối amoni ở dung dịch khi gặp formol cũng làm cho dung dịch trở thành acid, do hình thành hexantylen tertramin và HCl.
Do đĩ ta cũng định lƣợng bằng NaOH
- Hĩa chất
Dung dịch formol trung tính Dung dịch NaOH 0,1N và 0,05N
Chỉ thị hỗn hợp: bromothymol xanh 0,04% và phenolphthalein 0,5% trong cồn theo tỉ lệ thể tích 5:4.
- Tiến hành
Lấy 10ml nƣớc mắm cho vào bình định mức 250ml, thêm nƣớc cất tới ngấn, lắc đều. Lấy 10ml từ bình định mức ra erlen, cho 15 giọt chỉ thị vào, sau đĩ cho từng giọt NaOH 0,1N đến khi dung dịch cĩ màu phớt xanh thì cho tiếp 5 ml dung dịch formol trung tính (dung dịch chuyển sang màu vàng xanh), chuẩn độ bằng NaOH 0,05N đến khi dung dịch chuyển từ màu vàng xanh sang màu tím.
Tiến hành xác định mẫu trắng, thay 10ml nƣớc mắm pha lỗng thành 10ml nƣớc.
- Tính kết quả
Namin = [(n1 – n2 ) x 0,0007 x 250 x 1000] / [10 x 10] g/l n1: Số ml NaOH dùng cho mẫu trắng
n2: Số ml NaOH dùng cho mẫu thí nghiệm
2.6.4 Xác định hàm lƣợng nitơ amoniac
- Nguyên tắc
Định lƣợng bằng cách kéo hơi nƣớc đẩy muối amoni ra khỏi thể tự do bằng một chất kiềm khơng mạnh lắm để tránh ảnh hƣởng tới thực phẩm. Dùng dung dịch acid sulfuric để hấp thụ amoniacsa và xác định lƣợng H2SO4 dƣ bằng dung dịch kiềm. 2NH4Cl + Mg(OH)2 → 2NH3 + 2H2O +MgCl2 2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4 - Hĩa chất Acid sulfuric 0,1N NaOH 25% Chỉ thị hỗn hợp
- Tiến hành
Lấy 20ml acid sulfuric 0,1N và 0,5ml hỗn hợp chỉ thị vào cốc 500ml. Đặt cốc sao cho đầu ống sinh hàn c ủa máy ngập hẳn vào dung dịch trong cốc.
Lấy chính xác 5ml nƣớc mắm cho vào máy c ất, cho tiếp 2m dung dịch NaOH 25%, sau đĩ thêm nƣớc cất vào cho đủ 50ml. Tiến hành chƣng cất.
- Tính tốn kết quả
Nm = [(n1 – n2) x 0,0014 x 1000] / 5 g/l n1: Số ml H2SO4 cho vào bình chuần
n2: Số ml NaOH dùng để chuẩn 2.6.5 Xác định muối NaCl - Hĩa chất Nitrat bạc 0,1N Chromat kali 10% - Tiến hành
Lấy ra 5ml cho vào bình tam giác 250ml, thêm nƣớc cất cho đ ủ 100ml. thêm 1ml dung dịch chromat kali. Đem đi chuẩn độ bằng nitrat bạc 0,1N cho đến khi dung dịch cĩ màu đỏ nâu.
- Tính tốn kết quả
NaCl = 29,25 x n g/l n: Số ml AgNO3 khi chuẩn độ
2.6.6 Xác định độ acid
- Hĩa chất
Dung dịch NaOH 0,1N Phenolphtalin 1%
Lấy 10ml nƣớc mắm cho vào bình định mức 250ml, thêm nƣớc cất tới ngấn bình, lắc đều. Lấy ra 20ml từ bình định mức cho vào erlen 100ml, thêm nƣớc cất cho đủ 50ml, cho vào bình 5 giọt phennolphtalin. Chuẩn độ bằng NaOH 0,1N đến khi dung dịch chuyển sang màu phớt hồng.
- Kết quả
Hàm lƣợng acid (Ax) tính theo số ml NaOH 0,1N dùng để trung hịa 1ml mẫu, đƣợc tính theo cơng thức:
Ax = (n * 250) / (10 * 20) g/l
n: thể tích (ml) NaOH 0,1N tiêu tốn khi chuẩn mẫu thí nghiệm.
2.7 Phƣơng pháp phân tích vi sinh vật 2.7.1 Tổng vi sinh vật hiếu khí 2.7.1 Tổng vi sinh vật hiếu khí
- Mơi trƣờng sử dụng
Saline Peptone Water (SPW) Plate Count Agar (PCA)
- Quy trình phân tích
Hút 25ml mẫu cho vào bình tam giác chứa 225ml SPW đã đƣợc hấp khử trùng, lắc đều. Sau khi đƣợc đồng nhất mẫu, dung dịch mẫu thu đƣợc cĩ nồng độ pha lỗng là 10-1 so với dung dịch ban đầu. Dịch mẫu đồng nhất đƣợc đem đi pha lỗng theo dãy thập phân đến độ pha lỗng cần thiết.
Từ mỗi độ pha lỗng, c ấy 1ml lên đĩa petri vơ trùng. Sau đĩ đổ vào đĩa mơi trƣờng PCA đã đƣợc làm nguội đến 450
C. Trộn đều dịch mẫu với mơi trƣờng, chờ đĩa thạch nguội thì lật ngƣợc đĩa lại và đem đi ủ ở nhiệt độ 300C trong 72 giờ.
Đếm các khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa sau khi ủ.
- Kết quả
A = N/(n₁Vf ₁ + n₂Vf ₂ + … + niVfi)
A: tổng vi khuẩn hiếu khí trong 1ml
N: tổng số khuẩn lạc đếm đƣợc trên đĩa n: số lƣợng đĩa c ấy ở mỗi độ pha lỗng V: thể tích dịch mẫu (ml) c ấy vào đĩa f: độ pha lỗng tƣơng ứng
2.7.2 Xác định tổng số Coliforms
- Mơi trƣờng sử dụng
Saline Peptone Water (SPW) Tryptone Soya Argar (TSA)
Brilliant Green Bile Lactose broth (BGBL)
- Quy trình phân tích
Hút 25ml mẫu cho vào bình tam giác chứa 225ml SPW đã đƣợc hấp khử trùng, lắc đều. Sau khi đƣợc đồng nhất mẫu, dung dịch mẫu thu đƣợc cĩ nồng độ pha lỗng là 10-1 so với dung dịch ban đầu. Dịch mẫu đồng nhất đƣợc đem đi pha lỗng theo dãy thập phân đến độ pha lỗng cần thiết.
Từ mỗi độ pha lỗng, cấy 1ml lên đĩa petri vơ trùng. Sau đĩ đổ mơi trƣờng TSA đã đƣợc đun chảy và làm nguội đến 450
C. Lắc trịn đĩa petri xuơi và ngƣợc chiều kim đồng hồ để trộn đều dịch mẫu với mơi trƣờng, để yên trong 30 phút. Bổ sung vào mỗi đĩa khoảng 10 – 15 ml mơi trƣờng thạch VRB ở nhiệt độ 450C lên trên mơi trƣờng TSA, chờ cho mơi trƣờng trong đĩa đơng đ ặc, đem ủ ở 370C trong 24 giờ. Sau thời gian ủ, đếm các khuẩn lạc trên đĩa petri cĩ màu đỏ đến đỏ sậm, cĩ quầng tủa muối mật, cĩ đƣờng kính > 0,5mm.
Chọn ít nhất 3 – 5 khuẩn lạc đặc trƣng ở mỗi đĩa cấy sang các ống nghiệm chứa mơi trƣờng BGBL, đem ủ ở 370
- Kết quả
A = (N / nvf ) * R N: tổng số khuẩn lạc đếm đƣợc n:số đĩa cĩ số khuẩn lạc đƣợc chọn v: thề tích mẫu (ml) cấy vào mỗi đĩa f: độ pha lỗng
R: tỉ lệ khẳng định = tỉ lệ giữa số khuẩn lạc sinh hơi trong BGBL với tổng số khuẩn lạc
2.7.3 Escherichia coli
- Mơi trƣờng sử dụng
Tryptone Soya Argar (TSA)
Brilliant Green Bile Lactose broth (BGBL) Mơi trƣờng EMB
Canh Tryptone Canh MR – VP
Thạch Simmon Citrate Thuốc thử Kovac’s Thuốc thử Methyl Red Thuốc thử α-naphtol 5% KOH 40%
- Quy trình phân tích
Hút 25ml mẫu cho vào bình tam giác chứa 225ml SPW đã đƣợc hấp khử trùng, lắc đều. Sau khi đƣợc đồng nhất mẫu, dung dịch mẫu thu đƣợc cĩ nồng độ pha lỗng là 10-1 so với dung dịch ban đầu. Lấy 1ml mẫu cho vào 10 ml mơi trƣờng BGBL, ủ ở 440C trong 24 giờ. Chọn các ống sinh hơi (mẫu khơng sinh hơi đƣợc coi là âm tính E.coli) cấy chuyền sang mơi trƣờng EMB, ủ ở 370C trong 24 giờ. Sau thời gian ủ,
chọn các khuẩn lạc đ ặc trƣng: trịn, lồi, đƣờng kính < 0,5 mm, cĩ ánh kim tím cấy chuyển sang mơi trƣờng TSA và ủ ở 370C trong 24 giờ. Sau đĩ cấy chuyển sang mơi trƣờng: 1 Tryptone, 2 MR – VP, 1 Simmons Citrate, ủ ở 370
C trong 24 giờ. Cuối cùng dùng các thuốc để test thử nghiệm IMViC.
- Kết quả
IMViC ++--
2.7.4 Staphylococcus aureus
- Mơi trƣờng sử dụng
Mơi trƣờng Baird Parker (BP) Tryptone Soya Argar (TSA)
Huyết tƣơng thỏ: đƣợc cố định bằng 0,1% EDTA hay sodium oxalate và phân phối 0,3 ml vào ống nghiệm nhỏ.
- Quy trình phân tích
Hút 25ml mẫu cho vào bình tam giác chứa 225ml SPW đã đƣợc hấp khử trùng, lắc đều. Sau khi đƣợc đồng nhất mẫu, dung dịch mẫu thu đƣợc cĩ nồng độ pha lỗng là 10-1 so với dung dịch ban đ ầu. Lấy 1ml mẫu cho vào cho vào đĩa petri chứa mơi trƣờng BP cĩ bổ sung egg yolk, cấy trang ra cho đều, ủ ở 370
C trong 48 giờ. Chọn khuẩn lạc đặc trƣng: trịn, lồi, cĩ tâm đen và cĩ quầng sáng bao quanh cấy chuyển lên mơi trƣờng TSA. Sau đĩ cấy vào ống nghiệm chứa huyết tƣơng thỏ, ủ ở 370
C. Theo dõi sau 2, 4, 6, 8 giờ, nếu khơng cĩ biểu hiện ngƣng kết sẽ ủ tiếp đến 24 giờ.
- Kết quả
S = N / nvf N: tổng số khuẩn lạc đếm đƣợc n:số đĩa cĩ số khuẩn lạc đƣợc chọn v: thề tích mẫu (ml) cấy vào mỗi đĩa
2.7.5 Xác định Salmonella
- Mơi trƣờng sử dụng
Rappaport-Vassiliadis Soya Peptone (RV) Xylose Lysine Desoxycholate (LXD) Tryptone Soya Argar (TSA)
Triple Sugar Iron (TSI) Mannitol Phenol Red broth Urea broth
Lysine Decarboxylase (LDC)
- Quy trình thực hiện
Hút 25ml mẫu cho vào bình tam giác chứa 225ml SPW đã đƣợc hấp khử trùng, lắc đều. Sau khi đƣợc đồng nhất mẫu, dung dịch mẫu thu đƣợc cĩ nồng độ pha lỗng là 10-1 so với dung dịch ban đầu, ủ ở 370C trong 24 giờ. Lấy 0,1 ml cấy vào 10 ml mơi trƣờng RV, ủ ở 420
C trong 24 giờ. Cấy chuyển sang mơi trƣờng XLD, ủ ở 370C trong 24 giờ. Khuẩn lạc đặc trƣng: trịn, lồi, trong suốt, cĩ tâm đen đơi khi tâm đen quá lớn bao trùm khuẩn lạc, mơi trƣờng xung quanh chuyển màu đỏ. Cấy chuyển sang mơi trƣờng TSA, ủ ở 370
C trong 24 giờ. Sau đĩ cấy chuyển vào mơi trƣờng thử nghiệm sinh hĩa: TSI, LDC, Urea broth, Mannitol phenol red broth, ủ ở 370C trong 24 giờ.
- Kết luận
TSI: đỏ/ vàng/ H2S (+)/ gas Mannitol (+)
Urea (-) LDC (+)
2.7.6 Shigella
- Mơi trƣờng sử dụng
Canh Tryptose Soya
Mơi trƣờng Tergitol – 7 Argar (T7A) Canh Gram Negative (GN)
Thạch MacConkey (MAC)
Thạch Xylose Lysine Desoxycholate (XLD) Lysine Desoxycholate broth (LD)
Thạch Hektoen Enteric (HE) Thạch Deoxycholate Citrat Argar Mannitol Phenol Red broth (MPR) Dulcitol Phenol Red broth (DPR) Triple Sugar Iron (TSI)
Thuốc thử oxidase Thuốc thử catalase
Mơi trƣờng thử nghiệm tính di động
- Quy trình phân tích
Lấy 25ml mẫu cho vào bình tam giác chứa 225ml canh Tryptone Soya l ắc đều. Sauk hi đồng nhất mẫu, đo pH và chỉnh về pH 7 +
-0,2, lấy nút bơng đ ậy kín miệng bình và đem ủ ở 370
C trong 20 giờ.
Sau khi ủ, cấy 0,1 ml sang 10 ml canh GN, ủ ở 370C trong 20 giờ.
Cấy dịch tăng sinh lên các mơi trƣờng thạch đĩa chọ n lọc: T7A, XLD, HE, MAC, … . Biểu hiện của Shigella trên các mơi trƣờng phân lập khác nhau. Mơi trƣờng T7A: mơi trƣờng ban đầu đục nhƣ sữa cĩ màu xanh hơi vàng nhạt. trên mơi trƣờng này thì
