- Nguyên tắc
Các acid amin trong dung dịch nƣớc thì trung tính, khơng những do hai nhĩm chức acid -COOH và amin –NH2 trung hịa lẫn nhau, mà do cả hai nhĩm chức ấy đều yếu, quá trình điện ly rất kém. Khi gặp formol, nhĩm – NH2=CH2 mất tính chất kiềm, do đĩ tính chất acid của nhĩm –COOH nỗi bật lên và cĩ thể định lƣợng bằng NaOH với phenolphtalein làm chất chỉ thị màu.
R-CH-COOH + OCH2 → R-CH-COOH +H2O l l
NH2 N=CH2
Muối amoni ở dung dịch khi gặp formol cũng làm cho dung dịch trở thành acid, do hình thành hexantylen tertramin và HCl.
Do đĩ ta cũng định lƣợng bằng NaOH
- Hĩa chất
Dung dịch formol trung tính Dung dịch NaOH 0,1N và 0,05N
Chỉ thị hỗn hợp: bromothymol xanh 0,04% và phenolphthalein 0,5% trong cồn theo tỉ lệ thể tích 5:4.
- Tiến hành
Lấy 10ml nƣớc mắm cho vào bình định mức 250ml, thêm nƣớc cất tới ngấn, lắc đều. Lấy 10ml từ bình định mức ra erlen, cho 15 giọt chỉ thị vào, sau đĩ cho từng giọt NaOH 0,1N đến khi dung dịch cĩ màu phớt xanh thì cho tiếp 5 ml dung dịch formol trung tính (dung dịch chuyển sang màu vàng xanh), chuẩn độ bằng NaOH 0,05N đến khi dung dịch chuyển từ màu vàng xanh sang màu tím.
Tiến hành xác định mẫu trắng, thay 10ml nƣớc mắm pha lỗng thành 10ml nƣớc.
- Tính kết quả
Namin = [(n1 – n2 ) x 0,0007 x 250 x 1000] / [10 x 10] g/l n1: Số ml NaOH dùng cho mẫu trắng
n2: Số ml NaOH dùng cho mẫu thí nghiệm
2.6.4 Xác định hàm lƣợng nitơ amoniac
- Nguyên tắc
Định lƣợng bằng cách kéo hơi nƣớc đẩy muối amoni ra khỏi thể tự do bằng một chất kiềm khơng mạnh lắm để tránh ảnh hƣởng tới thực phẩm. Dùng dung dịch acid sulfuric để hấp thụ amoniacsa và xác định lƣợng H2SO4 dƣ bằng dung dịch kiềm. 2NH4Cl + Mg(OH)2 → 2NH3 + 2H2O +MgCl2 2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4 - Hĩa chất Acid sulfuric 0,1N NaOH 25% Chỉ thị hỗn hợp
- Tiến hành
Lấy 20ml acid sulfuric 0,1N và 0,5ml hỗn hợp chỉ thị vào cốc 500ml. Đặt cốc sao cho đầu ống sinh hàn c ủa máy ngập hẳn vào dung dịch trong cốc.
Lấy chính xác 5ml nƣớc mắm cho vào máy c ất, cho tiếp 2m dung dịch NaOH 25%, sau đĩ thêm nƣớc cất vào cho đủ 50ml. Tiến hành chƣng cất.
- Tính tốn kết quả
Nm = [(n1 – n2) x 0,0014 x 1000] / 5 g/l n1: Số ml H2SO4 cho vào bình chuần
n2: Số ml NaOH dùng để chuẩn 2.6.5 Xác định muối NaCl - Hĩa chất Nitrat bạc 0,1N Chromat kali 10% - Tiến hành
Lấy ra 5ml cho vào bình tam giác 250ml, thêm nƣớc cất cho đ ủ 100ml. thêm 1ml dung dịch chromat kali. Đem đi chuẩn độ bằng nitrat bạc 0,1N cho đến khi dung dịch cĩ màu đỏ nâu.
- Tính tốn kết quả
NaCl = 29,25 x n g/l n: Số ml AgNO3 khi chuẩn độ
2.6.6 Xác định độ acid
- Hĩa chất
Dung dịch NaOH 0,1N Phenolphtalin 1%
Lấy 10ml nƣớc mắm cho vào bình định mức 250ml, thêm nƣớc cất tới ngấn bình, lắc đều. Lấy ra 20ml từ bình định mức cho vào erlen 100ml, thêm nƣớc cất cho đủ 50ml, cho vào bình 5 giọt phennolphtalin. Chuẩn độ bằng NaOH 0,1N đến khi dung dịch chuyển sang màu phớt hồng.
- Kết quả
Hàm lƣợng acid (Ax) tính theo số ml NaOH 0,1N dùng để trung hịa 1ml mẫu, đƣợc tính theo cơng thức:
Ax = (n * 250) / (10 * 20) g/l
n: thể tích (ml) NaOH 0,1N tiêu tốn khi chuẩn mẫu thí nghiệm.
2.7 Phƣơng pháp phân tích vi sinh vật 2.7.1 Tổng vi sinh vật hiếu khí 2.7.1 Tổng vi sinh vật hiếu khí
- Mơi trƣờng sử dụng
Saline Peptone Water (SPW) Plate Count Agar (PCA)
- Quy trình phân tích
Hút 25ml mẫu cho vào bình tam giác chứa 225ml SPW đã đƣợc hấp khử trùng, lắc đều. Sau khi đƣợc đồng nhất mẫu, dung dịch mẫu thu đƣợc cĩ nồng độ pha lỗng là 10-1 so với dung dịch ban đầu. Dịch mẫu đồng nhất đƣợc đem đi pha lỗng theo dãy thập phân đến độ pha lỗng cần thiết.
Từ mỗi độ pha lỗng, c ấy 1ml lên đĩa petri vơ trùng. Sau đĩ đổ vào đĩa mơi trƣờng PCA đã đƣợc làm nguội đến 450
C. Trộn đều dịch mẫu với mơi trƣờng, chờ đĩa thạch nguội thì lật ngƣợc đĩa lại và đem đi ủ ở nhiệt độ 300C trong 72 giờ.
Đếm các khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa sau khi ủ.
- Kết quả
A = N/(n₁Vf ₁ + n₂Vf ₂ + … + niVfi) A: tổng vi khuẩn hiếu khí trong 1ml
N: tổng số khuẩn lạc đếm đƣợc trên đĩa n: số lƣợng đĩa c ấy ở mỗi độ pha lỗng V: thể tích dịch mẫu (ml) c ấy vào đĩa f: độ pha lỗng tƣơng ứng
2.7.2 Xác định tổng số Coliforms
- Mơi trƣờng sử dụng
Saline Peptone Water (SPW) Tryptone Soya Argar (TSA)
Brilliant Green Bile Lactose broth (BGBL)
- Quy trình phân tích
Hút 25ml mẫu cho vào bình tam giác chứa 225ml SPW đã đƣợc hấp khử trùng, lắc đều. Sau khi đƣợc đồng nhất mẫu, dung dịch mẫu thu đƣợc cĩ nồng độ pha lỗng là 10-1 so với dung dịch ban đầu. Dịch mẫu đồng nhất đƣợc đem đi pha lỗng theo dãy thập phân đến độ pha lỗng cần thiết.
Từ mỗi độ pha lỗng, cấy 1ml lên đĩa petri vơ trùng. Sau đĩ đổ mơi trƣờng TSA đã đƣợc đun chảy và làm nguội đến 450
C. Lắc trịn đĩa petri xuơi và ngƣợc chiều kim đồng hồ để trộn đều dịch mẫu với mơi trƣờng, để yên trong 30 phút. Bổ sung vào mỗi đĩa khoảng 10 – 15 ml mơi trƣờng thạch VRB ở nhiệt độ 450C lên trên mơi trƣờng TSA, chờ cho mơi trƣờng trong đĩa đơng đ ặc, đem ủ ở 370C trong 24 giờ. Sau thời gian ủ, đếm các khuẩn lạc trên đĩa petri cĩ màu đỏ đến đỏ sậm, cĩ quầng tủa muối mật, cĩ đƣờng kính > 0,5mm.
Chọn ít nhất 3 – 5 khuẩn lạc đặc trƣng ở mỗi đĩa cấy sang các ống nghiệm chứa mơi trƣờng BGBL, đem ủ ở 370
- Kết quả
A = (N / nvf ) * R N: tổng số khuẩn lạc đếm đƣợc n:số đĩa cĩ số khuẩn lạc đƣợc chọn v: thề tích mẫu (ml) cấy vào mỗi đĩa f: độ pha lỗng
R: tỉ lệ khẳng định = tỉ lệ giữa số khuẩn lạc sinh hơi trong BGBL với tổng số khuẩn lạc
2.7.3 Escherichia coli
- Mơi trƣờng sử dụng
Tryptone Soya Argar (TSA)
Brilliant Green Bile Lactose broth (BGBL) Mơi trƣờng EMB
Canh Tryptone Canh MR – VP
Thạch Simmon Citrate Thuốc thử Kovac’s Thuốc thử Methyl Red Thuốc thử α-naphtol 5% KOH 40%
- Quy trình phân tích
Hút 25ml mẫu cho vào bình tam giác chứa 225ml SPW đã đƣợc hấp khử trùng, lắc đều. Sau khi đƣợc đồng nhất mẫu, dung dịch mẫu thu đƣợc cĩ nồng độ pha lỗng là 10-1 so với dung dịch ban đầu. Lấy 1ml mẫu cho vào 10 ml mơi trƣờng BGBL, ủ ở 440C trong 24 giờ. Chọn các ống sinh hơi (mẫu khơng sinh hơi đƣợc coi là âm tính E.coli) cấy chuyền sang mơi trƣờng EMB, ủ ở 370C trong 24 giờ. Sau thời gian ủ,
chọn các khuẩn lạc đ ặc trƣng: trịn, lồi, đƣờng kính < 0,5 mm, cĩ ánh kim tím cấy chuyển sang mơi trƣờng TSA và ủ ở 370C trong 24 giờ. Sau đĩ cấy chuyển sang mơi trƣờng: 1 Tryptone, 2 MR – VP, 1 Simmons Citrate, ủ ở 370
C trong 24 giờ. Cuối cùng dùng các thuốc để test thử nghiệm IMViC.
- Kết quả
IMViC ++--
2.7.4 Staphylococcus aureus
- Mơi trƣờng sử dụng
Mơi trƣờng Baird Parker (BP) Tryptone Soya Argar (TSA)
Huyết tƣơng thỏ: đƣợc cố định bằng 0,1% EDTA hay sodium oxalate và phân phối 0,3 ml vào ống nghiệm nhỏ.
- Quy trình phân tích
Hút 25ml mẫu cho vào bình tam giác chứa 225ml SPW đã đƣợc hấp khử trùng, lắc đều. Sau khi đƣợc đồng nhất mẫu, dung dịch mẫu thu đƣợc cĩ nồng độ pha lỗng là 10-1 so với dung dịch ban đ ầu. Lấy 1ml mẫu cho vào cho vào đĩa petri chứa mơi trƣờng BP cĩ bổ sung egg yolk, cấy trang ra cho đều, ủ ở 370
C trong 48 giờ. Chọn khuẩn lạc đặc trƣng: trịn, lồi, cĩ tâm đen và cĩ quầng sáng bao quanh cấy chuyển lên mơi trƣờng TSA. Sau đĩ cấy vào ống nghiệm chứa huyết tƣơng thỏ, ủ ở 370
C. Theo dõi sau 2, 4, 6, 8 giờ, nếu khơng cĩ biểu hiện ngƣng kết sẽ ủ tiếp đến 24 giờ.
- Kết quả
S = N / nvf N: tổng số khuẩn lạc đếm đƣợc n:số đĩa cĩ số khuẩn lạc đƣợc chọn v: thề tích mẫu (ml) cấy vào mỗi đĩa
2.7.5 Xác định Salmonella
- Mơi trƣờng sử dụng
Rappaport-Vassiliadis Soya Peptone (RV) Xylose Lysine Desoxycholate (LXD) Tryptone Soya Argar (TSA)
Triple Sugar Iron (TSI) Mannitol Phenol Red broth Urea broth
Lysine Decarboxylase (LDC)
- Quy trình thực hiện
Hút 25ml mẫu cho vào bình tam giác chứa 225ml SPW đã đƣợc hấp khử trùng, lắc đều. Sau khi đƣợc đồng nhất mẫu, dung dịch mẫu thu đƣợc cĩ nồng độ pha lỗng là 10-1 so với dung dịch ban đầu, ủ ở 370C trong 24 giờ. Lấy 0,1 ml cấy vào 10 ml mơi trƣờng RV, ủ ở 420
C trong 24 giờ. Cấy chuyển sang mơi trƣờng XLD, ủ ở 370C trong 24 giờ. Khuẩn lạc đặc trƣng: trịn, lồi, trong suốt, cĩ tâm đen đơi khi tâm đen quá lớn bao trùm khuẩn lạc, mơi trƣờng xung quanh chuyển màu đỏ. Cấy chuyển sang mơi trƣờng TSA, ủ ở 370
C trong 24 giờ. Sau đĩ cấy chuyển vào mơi trƣờng thử nghiệm sinh hĩa: TSI, LDC, Urea broth, Mannitol phenol red broth, ủ ở 370C trong 24 giờ.
- Kết luận
TSI: đỏ/ vàng/ H2S (+)/ gas Mannitol (+)
Urea (-) LDC (+)
2.7.6 Shigella
- Mơi trƣờng sử dụng
Canh Tryptose Soya
Mơi trƣờng Tergitol – 7 Argar (T7A) Canh Gram Negative (GN)
Thạch MacConkey (MAC)
Thạch Xylose Lysine Desoxycholate (XLD) Lysine Desoxycholate broth (LD)
Thạch Hektoen Enteric (HE) Thạch Deoxycholate Citrat Argar Mannitol Phenol Red broth (MPR) Dulcitol Phenol Red broth (DPR) Triple Sugar Iron (TSI)
Thuốc thử oxidase Thuốc thử catalase
Mơi trƣờng thử nghiệm tính di động
- Quy trình phân tích
Lấy 25ml mẫu cho vào bình tam giác chứa 225ml canh Tryptone Soya l ắc đều. Sauk hi đồng nhất mẫu, đo pH và chỉnh về pH 7 +
-0,2, lấy nút bơng đ ậy kín miệng bình và đem ủ ở 370
C trong 20 giờ.
Sau khi ủ, cấy 0,1 ml sang 10 ml canh GN, ủ ở 370C trong 20 giờ.
Cấy dịch tăng sinh lên các mơi trƣờng thạch đĩa chọ n lọc: T7A, XLD, HE, MAC, … . Biểu hiện của Shigella trên các mơi trƣờng phân lập khác nhau. Mơi trƣờng T7A: mơi trƣờng ban đầu đục nhƣ sữa cĩ màu xanh hơi vàng nhạt. trên mơi trƣờng này thì khuẩn lạc Shigella cĩ màu xanh nhạt. Mơi trƣờng MAC: khuẩn lạc cĩ màu nâu đỏ,
Deoxycholate Citrat Argar: mơi trƣờng cĩ màu đỏ cam, hơi đục, khuẩn lạc cĩ màu đỏ nhạt. Mơi trƣờng HE: khuẩn lạc cĩ màu xanh nhạt, trong suốt.
Chọn các khuẩn lạc cấy sang mơi trƣờng BHI hoặc TSA, ủ ở 370C trong 20 giờ. Các khuẩn lạc xuất hiện trên mơi trƣờng này đƣợc cấy sang mơi trƣờng TSI, ủ ở 370C trong 24 giờ để thử nghiệm sinh hĩa khẳng định.
- Kết quả
Thử nghiệm sinh hĩa cho kết quả
TSI: đỏ/ vàng/ H2S (-)/ gas (-) Oxydase (-)
Khơng di động trong thạch mềm Thử nghiệm sinh hĩa khẳng định Shigella spp
Simmon citrate (-) MR (+) Adonitol (-) Arginine decarboxylase (-) Lysine decarboxylase (-)
Urease (-) Malonate (-)
VP (-) Salicine (-) Xylose (-) Cellobiose (-) Dulcitol (-) Inositol (-)
CHƢƠNG 3
QUY TRÌNH SẢN XUẤT NƢỚC MẮM LÊN MEN
3.1 Bản chất của quá trình lên men nƣớc mắm từ đậu nành 3.1.1Cơ sở sinh hĩa của quá trình lên men 3.1.1Cơ sở sinh hĩa của quá trình lên men
Chúng ta lợi dụng hệ men của vi sinh vật phát triển trên nguyên liệu giàu đạm, để rồi chúng thủy phân protein cĩ trong nguyên liệu thành các sản phầm nhƣ polypeptide, oligopeptide, acid amin. Trong quá trình s ản xuất, chúng ta phải nuơi vi sinh vật trong điều thuận lợi cho vi sinh vật phát triển tốt để cĩ nhiều enzyme thủy phân, năng suất thủy phân protein cĩ trong nguyên liệu cao thì sẽ nâng cao năng suất, hạ giá thành sản phẩm và nâng cao chất lƣợng của nƣớc chấm thành phẩm.
Trong s ản xuất nƣớc mắm lên men từ đậu nành, ta dùng enzyme protease và proteinase của vi khuẩn bacillus để thủy phân protein c ủa đậu nành thành acid amin.
3.1.2 Cơ chế của quá trình hình thành nƣớc mắm khi lên men đậu nành
Đậu nành đem trộn với nƣớc muối theo tỷ lệ nhất định, lên men trong điều kiện thích hợp. Sau một thời gian sẽ hình thành một dung dịch acid amin và các chất khác.
Bản chất của quá trình này chính là quá trình thủy phân protein trong đ ậu nành nhờ hệ enzyme protease và proteniase c ủa vi khuẩn bacillus subtilis.
Protein → polypeptide → peptid → acid amin
Quá trình thủy phân protein đến các acid amin là 1 quá trình rất phức tạp. Sự tham gia của enzyme trong quá trình thủy phân theo cơ chế xúc tác E + S ES E + P với E là enzyme, S là cơ chất (protein), ES là hợp chất trung gian giữa enzyme và cơ chất, P là sản phẩm tạo thành. Sản phẩm chủ yếu của quá trình phân giải protein là amino acid và các peptid cấp thấp. Sự tạo thành và chuyển biến hợp chất ES qua 3 bƣớc:
Bƣớc 1: Enzyme kết hợp với protein tạo thành phức chất enzyme protein, bƣớc này xảy ra khá nhanh, liên kết khơng bền.
Bƣớc 2: Xảy ra sự chuyển biến của các phân tử protein dẫn đến làm phá vỡ các mối liên kết đồng hĩa trị tham gia vào phản ứng. Khi đĩ phức ES đồng thời xảy ra hai quá trình là sự dịch chuyển thay đổi electron, dẫn đến sự cực hĩa của mối liên kết
tham gia vào phản ứng và sự biến dạng hình học của nối liên kết đồng hĩa trị trong phân tử protein cũng nhƣ trong tâm hoạt động của enzyme, quá trình thủy phân sẽ dễ dàng hơn.
Bƣớc 3: Giai đoạn tạo thành các amino acid và peptid, giải phĩng enzyme. Ngồi ra, đƣờng và chất béo cũng bị phân giải thành rƣợu và các acid hữu cơ.
3.2 Các hệ enzyme tham gia vào quá trình thủy phân
α-Amylase: Là một enzyme ngoại bào tạo ra mantose, dextrin, mantotriose. Nĩ cắt đứt nối đơi α-1-4-glucocide.
Protease: Là một nhĩm enzyme phân giải protein (protease, peptidase, proteinase,..) mà phần lớn là đƣợc tế bào tiết ra ngồi mơi trƣờng và hoạt động bên ngồi mơi trƣờng. Các protein đƣợc phân giải ngồi tế bào nhờ các enzyme ngoại để tạo thành polypeptide và olygopeptide và sau đĩ phân giải thành các amino acid.
3.3 Ƣu và nhƣợc điểm của quá trình lên men
- Ƣu điểm:
Thiết bị đơn giản
Khơng dùng hĩa chất trong s ản xuất Khơng tổn hao acid amin trong sản xuất
- Nhƣợc điểm:
Hiệu suất thủy phân khơng cao
3.4 Sơ đồ quy trình sản xuất nƣớc mắm lên men từ đậu nành
Nước muối
Đậu nành Ngâm Rửa, tách vỏ Hấp chín
Làm nguội Rang chín sơ Phối trộn Lên men ủ Trích ly lần 1 Nƣớc 1 Bã Trích ly lần 2 Nƣớc 2 Phối chế Lọc tinh
Thanh trùng Vơ chai Gạo mì Giống Sản phẩm nước mắm chay Bã Nước muối
3.5 Thuyết minh quy trình
- Nguyên liệu
Đậu nành là nguyên liệu chính trong sản xuất nƣớc mắm lên men từ đậu nành, nĩ quyết định tỷ lệ thu hồi protein và chất lƣợng sản phẩm. Do đĩ trong sản xuất, đ ậu nành phải đƣợc lựa chọn đúng tiêu chuẩn: Hạt chín về mặt sinh học, lo ại bỏ những hạt non. Chúng ta phải chọn những hạt to, đều, khơng cĩ vết bệnh, khơng dị dạng, màu sắc vỏ và rốn hạt đ ặc trƣng c ủa giống đ ậu nành, khơ, sạch, khơng sâu mọt, khơng cĩ mùi hơi. Độ ẩm của hạt thấp, khoảng 10-13%. Vỏ hạt màu nâu vàng nhạt, tránh sử dụng những hạt cĩ vỏ màu xanh vì hợp chất chlorophyll cĩ trong vỏ hạt hay trong lá mầm sẽ tạo vị đắng và chuyển thành hợp chất phytophytin (màu nâu) trong quá trình chế biến. Hạt nứt khơng quá 5% khối lƣợng, hạt hƣ khơng quá 2% khối lƣợng, hạt xanh khơng quá 2%. Tạp chất khơng quá 3% khối lƣợng.
- Giai đoạn ngâm hạt
Đây là quá trình lên men tự nhiên khá phức tạp và nĩ quyết định mùi vị đặc trƣng của sản phẩm, pH nƣớc = 5.5 cĩ tác dụng phù hợp với quá trình xúc tác và chuyển hĩa của hỗn hợp enzyme amilase và protease và một số enzyme khác khi lên men.