1.3.1 Giới thiệu về nguyên liệu muối
Muối trong tự nhiên gồm cĩ mỏ, muối giếng, muối ở đáy hồ nƣớc mặn và muối biển. Tùy theo phẩm chất và cơng dụng của mỗi loại muối ngƣời ta chia ra: muối ăn – muối cơng nghiệp – muối làm phân. Muối dùng để sản xuất nƣớc mắm là muối ăn.
là NaCl, ngo ài ra cịn cĩ các t ạp chất nhƣ canxi, magie…, tỷ lệ của muối NaCl và các tạp chất tùy thuộc vào từng loại muối mà ngƣời ta muốn sản xuất. Muối sử dụng trong sản xuất nƣớc chấm cĩ chất lƣợng càng tốt sẽ giúp cho nƣớc chấm càng thơm ngon.
Yêu c ầu của muối trong sản xuất nƣớc chấm phải là muối ăn ( NaCl ), cĩ độ tinh khiết cao. Tốt nhất là muối kết tinh hạt nhỏ, cĩ độ rắn cao, màu tr ắng ĩng ánh, khơng đĩng thành cục, khơng cĩ vị đắng chát.
Nồng độ muối thấp cĩ tác dụng thúc đẩy quá trình thủy phân prontein nhanh hơn và tạo thành acid amin nhiều hơn. Nồng độ muối cĩ tác dụng ức chế, làm mất hoạt tính c ủa enzyme, quá trình thủy phân bị chậm lại, thời gian thủy phân kéo dài. Nồng độ muối ảnh hƣởng mạnh mẽ đến vi sinh vật. Nồng độ muối cao sẽ ức chế vi sinh vật phát triển. Cịn nồng độ muối thấp thì mốc dễ dàng phát triển cùng với một số vi khuẩn gây thối phát triển và làm hƣ hỏng sản phẩm. Thƣờng lƣợng muối cho vào quá trình lên men kho ảng 20 – 25% so với lƣợng nƣớc.
Bảng 1.14. Thành phần hĩa học của muối
Loại muối % NaCl % Nƣớc % Chất khơng
tan % Chất tan 1 90 7 0,50 2,50 2 85 10 0,65 4,35 3 80 13 0,80 6,20 1.3.2 Nƣớc dùng để sản xuất
Nƣớc dùng là nguyên liệu rất quan trọng trong quá trình sản xuất, nƣớc dùng để rửa nguyên liệu, làm vệ sinh các dụng c ụ máy mĩc thiết bị, dùng để thanh trùng,… vì vậy nƣớc cần dùng với một lƣợng rất lớn.
Nƣớc dùng trong cơng nghệ sản xuất nƣớc chấm phải đạt các chỉ tiêu của nƣớc dùng trong s ản xuất thực phẩm. Nƣớc phải trong sạch, khơng cĩ màu s ắc và mùi vị lạ, khơng cĩ cặn bẩn và các kim loại nặng, c ác chất khống và các chất hữu cơ khác
khơng đƣợc quá 500 – 600 mg/l. Lƣợng vi sinh vật khơng đƣợc quá 20 – 100 con/ml nƣớc. Đặt biệt khơng cĩ vi sinh vật gây bệnh.
1.3.3 Phụ gia
- Nƣớc màu
Nƣớc màu cĩ tác dụng làm cho nƣớc mắm đƣợc dịu ngọt, màu vàng đẹp. Cách làm nƣớc màu: nấu đƣờng đến độ ngả màu cánh gián, thử vào nƣớc lã thấy vĩn cục là đƣợc, dùng vải lọc để lọc lấy nƣớc màu và phối chế vào nƣớc mắm.
- Quả thơm
Dùng quả thơm chín cho vào quá trình ủ nƣớc mắm để cho nƣớc mắm sau này cĩ hƣơng thơm.
Bảng 1.15 Chỉ tiêu c ủa nƣớc sử dụng trong thực phẩm
Các chỉ tiêu Tiêu chuẩn
Các chỉ tiêu lý và hĩa học
Mùi vị Khơng cĩ mùi lạ
Màu sắc Trong suốt 15mg/l Pt
Độ đục 5 mg/l
pH 6.0 – 8.0
Hàm lƣợng oxy hịa tan, tính theo oxy 6 mg/l
Độ cứng, tính theo CaCO3 300 mg/l
Tồng chất rắn hịa tan 1000 mg/l
Hàm lƣợng ammoniac, tính theo nitơ 3 mg/l
Hàm lƣợng hydrosunfua 0,05 mg/l Hàm lƣợng sắt tổng số (Fe2+ và Fe3+) 0,5 mg/l Hàm lƣợng mangan 0,5 mg/l Hàm lƣợng nhơm 0,5 mg/l Hàm lƣợng cyanua 0,07 mg/l Hàm lƣợng clorua 250 mg/l
Hàm lƣợng nitrit, tính theo nitơ 1 mg/l
Hàm lƣợng nitrat, tính theo nitơ 10 mg/l
Hàm lƣợng chì 0,01 mg/l
Hàm lƣợng asen 0,01 mg/l
Hàm lƣợng đồng 1 mg/l
Hàm lƣợng kẽm 3 mg/l
Hàm lƣợng thuốc trừ sâu phân hữu cơ 0,01 mg/l Hàm lƣợng thuốc trừ sâu clo hữu cơ 0,1 mg/l
Chỉ tiêu vi sinh vật
Tồng số vi sinh vật hiếu khí 100 tế bào/cm3
Coliform tổng 2,2 MPN/100ml
E.coli và coliform chịu nhiệt Khơng đƣợc cĩ
Vi sinh vật gây bệnh khác Khơng đƣợc cĩ
1.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men
Lên men là dùng enzyme của vi khuẩn để thủy phân protein trong đậu nành và tinh bột trong gạo nếp thành nƣớc mắm. Điều khác biệt giữa sự lên men và thối rữa là sau khi lên men xong khơng sinh ra mùi thối. Lên men cũng là một giai đoạn quan trọng, nếu xử lý nguyên liệu tốt, nuơi vi khuẩn đúng kỹ thuật mà lên men khơng đảm bảo thì nƣớc mắm vẫn khơng đạt yêu cầu, hiệu suất khơng cao. Ba yếu tố ảnh hƣởng quan trọng trong việc lên men là: nhiệt độ lên men, thời gian lên men và lƣợng nƣớc cho vào nguyên liệu khi lên men.
1.4.1 Lƣợng nƣớc cho vào trong quá trình lên men
Lƣợng nƣớc cho vào trong quá trình thủy phân phải phù hợp thì quá trình thủy phân sẽ xảy ra nhanh hơn. Theo kinh nghiệm của các xí nghiệp sản xuất nƣớc chấm cho thấy lƣợng nƣớc cho vào quá trình thủy phân tốt nhất là 30 – 40 % so với nguyên liệu, khi cho nƣớc vào nên cho 5 – 10 % muối NaCl và duy trì ở nhiệt độ thủy phân thích hợp trong suốt thời gian lên men. Để tính lƣợng nƣớc cần thiết cho quá trình thủy phân, ta s ử dụng cơng thức sau:
W = (A*B) – C Trong đĩ:
W: Lƣợng nƣớc cần cho vào
A: Khối lƣợng vi khuẩn khơng nƣớc B: % khối lƣợng nƣớc trộn vào C: Hàm lƣợng nƣớc của vi khuẩn
Ảnh hƣởng của nƣớc đến tốc độ của các quá trình thủy phân trong sản phẩm nƣớc mắm đƣợc quyết định bởi các yếu tố sau:
- Sự phân bố của các chất tham gia phản ứng ở trong s ản phẩm.
- Độ linh động của cơ chất do trạng thái tập hợp và cấu trúc sản phẩm quyết định.
- Hoạt độ nƣớc
1.4.2 Nhiệt độ khi lên men
Nhiệt độ lên men hết sức quan trọng vì nĩ tạo điều kiện cho enzyme của vi khuẩn xúc tác cho các quá trình thủy phân protein và tinh bột thành đƣờng, các amino acid,... Nhiệt độ cũng ảnh hƣởng đến sự phát triển của vi sinh vật. Mỗi loại vi sinh vật thích ứng với một nhiệt độ nhất định. Do đĩ ta cần tạo một điều kiện tối ƣu cho vi
Trong quá trình chế biến, khi nhiệt độ tăng thì vận tốc phản ứng của các enzyme sẽ tăng. Nếu nhiệt độ tăng cao quá thì sẽ ức chế sự ho ạt động của enzyme và quá trình thủy phân sẽ giảm, đồng thời làm cho s ản phẩm cĩ mùi khét, đ ắng. Nếu nhiệt độ thấp sẽ kéo dài thời gian lên men, s ản phẩm cĩ màu nhạt và năng suất sản phẩm khơng cao. Nhiệt độ thích hợp cho các enzyme của vi khuẩn hoạt động là khoảng từ 37-500C.
1.4.3 Thời gian lên men
Tùy theo lƣợng nƣớc trộn vào và điều kiện nhiệt độ khi lên men mà thời gian lên men dài hay ngắn. Chúng ta cũng cĩ thể căn cứ vào sự tăng giảm của N formol để quyết thời gian lên men.
Sau khi thủy phân xong, căn cứ vào hàm lƣợng nƣớc trong dịch thủy phân để tính hàm lƣợng muối và nƣớc muối bổ sung vào cho đạt nồng độ quy định và số lƣợng nƣớc chấm cần thiết lấy ra.
1.4.4 Ảnh hƣởng của pH
Mỗi hệ enzyme cĩ pH tối thiểu khác nhau. Vì vậy phải xem loại enzyme nào nhiều nhất và đĩng vai trị chủ yếu nhất trong quá trình s ản xuất nƣớc chấm, ta phải tạo độ pH thích hợp cho enzyme đĩ ho ạt động.
Qua thực nghiệm cho thấy, pH = 4 – 5 thích hợp cho quá trình lên men. Đồng thời, ở pH này cịn cĩ tác dụng ức chế vi khuẩn gây thối phát triển.
CHƢƠNG 2
CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Các phƣơng pháp xác định hình thái vi khuẩn 2.1.1 Nhuộm Gram 2.1.1 Nhuộm Gram
Nguyên tắc dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh và Iot mà hình thành nên hai loại phức chất khác nhau.
Loại phức chất thứ nhất vẫn giữ nguyên màu của thuốc nhuộm nên khơng bị rửa trơi khi xử lý bằng cồn. Vi sinh vật cĩ phức chất này thuộc loại Gram dƣơng. Loại phức chất thứ hai khơng cịn giữ đƣợc màu của thuốc nhuộm nên mất màu khi xử lý bằng cồn và bắt màu của thuốc nhuộm bổ sung. Vi sinh vật cĩ lo ại phức chất này thuộc Gram âm.
Cách tiến hành :
- Làm tiêu bản : Dùng que cấy lấy nƣớc cất vơ trùng làm vết bơi lên phiến kính (lấy một ít khuẩn lạc làm vết bơi). Để khơ vết bơi trong khơng khí hoặc cố định trên ngọn lửa đèn cồn.
- Nhuộm tiêu bản : Nhuộm tím kết tinh lên vết bơi để yên trong 1 phút. Sau đĩ rửa nƣớc và thấm khơ nhuộm lugol trong 1 phút. Sau đĩ rửa nƣớc và thấm khơ rửa vết bơi bằng cồn 96 trong 30 giây, r ửa nƣớc thấm khơ nhuộm với Fucshin trong 30 giây, rửa nƣớc thấm khơ vết bơi quan sát dƣới kính hiển vi ổ vật kính 100x
Đọc kết quả : Tế bào bắt màu hồng (Gram âm). Tế bào bắt mảu tím (Gram dƣơng).
2.1.2 Nhuộm bào tử
Sự hình thành bào tử là một hình thức đổi mới tế bào khi gặp những điều kiện bất lợi trong chu trình sống (nhiệt độ, áp suất, pH…).Nguyên tắc nhuộm dựa trên cấu trúc đặc biệt của màng bào tử (dày, chắc, khĩ bắt màu, chứa nhiều lipid). Trƣớc hết xử lý để tế bào chất của bào tử và tế bào bằng thuốc nhuộm cĩ hoạt tính mạnh. Sau đĩ tẩy màu tế bào chất của tế bào đi và nhuộm nĩ bằng một thuốc nhuộm khác bổ sung. Nhờ đĩ, tế bào chất của bào từ và tế bào chất của tế bào bắt màu phân biệt.
Phƣơng pháp nhuộm nhƣ sau: Làm vết bơi và cố định vết bơi tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp nhuộm Gram đã trình bày ở trên. Sau đĩ nhuộm vết bơi bằng malachite trong vịng 10 phút, r ửa nƣớc và thấm khơ nhuộm vết bơi bằng Fucshin trong 30 giây, rửa nƣớc thấm khơ quan sát dƣới kính hiển vi.
Đọc kết quả : Tế bào bắt màu hồng cịn bào tử bắt màu xanh lục.
2.1.3 Nhuộm vỏ nhày
Các bƣớc tiến hành nhƣ sau :
- Nhỏ vài giọt dung dịch tím kết tinh lên phiến kính
- Lấy một ít khuẩn lạc trộn đều tím kết tính đã cĩ sẵn trên phiến kính, dàn đều vết bơi, nhuộm trong vịng 5 – 7 phút rửa vết bơi bằng dung dịch CuSO4 20%, rửa nƣớc thấm khơ quan sát dƣới kính hiển vi
Đọc kết quả: Tế bào cĩ màu sẫm cịn vỏ nhày cĩ màu nhạt ở xung quanh.
2.2 Các phản ứng sinh hĩa xác định vi sinh vật 2.2.1 Thử nghiệm Catalase 2.2.1 Thử nghiệm Catalase
Nguyên tắc của thử nghiệm này nhằm xác định hiện diện của enzyme catalase c ủa vi sinh vật.
Cơ sở sinh hĩa nhƣ sau: enzyme catalase hiện diện trong hầu hết các vi sinh vật hiếu khí cĩ hệ thống cytochrom. Những vi sinh vật kỵ khí nhƣ Clostridium cĩ hệ thống peroxydase thay cho enzyme catalase. Tuy thế enzyme catalase hoạt động khơng chuyên biệt và chúng cĩ thể can thiệp vào hoạt động của enzyme peroxidase.
Phƣơng pháp tiến hành thử nghiệm: Hĩa chất sử dụng là H2O2 30%. Dùng que c ấy vịng lấy một ít sinh khối đ ặt lên lame, nhỏ một giọt H2O2 30% lên sinh khối vi sinh vật, ho ặc cĩ thể thử trong ống thạch nghiêng và đĩa petri mơi trƣờng đặc, tƣơng tự nhỏ 1 giọt H2O2 30% lên sinh khối của vi sinh vật.
Đọc kết quả: Thử nghiệm (+) khi cĩ hiện tƣợng sủi bọt khí, thử nghiệm (-) là khơng cĩ hiện tƣợng sủi bọt.
2.2.2 Thử nghiệm khả năng sinh Indol
Nguyên tắc: Phát hiện khả năng của vi khuẩn cĩ thể tạo Indol trong mơi trƣờng trypton. Các hợp chất trung gian trong quá trình thủy giải tryptophan là acid indolpyruvic, từ đĩ indol đƣợc hình thành thơng qua quá trình khử amin, hình thành skatol (metyl indol) là quá trình khử carboxyl cùa acid indol acetic. Enzyme tryptophan xúc tác phản ứng khử amin của tryptophan và tách nhân thơm ra khỏi phân tử tryptophan hình thành indol. Việc phát hiện indol đƣợc thực hiện bằng phản ứng giữa phân từ này với thuốc thử chứa p-dimethylaminobenzaldehyde (p-DMAB). Nhân pyrrol của indol chứa nhĩm –CH2 sẽ kết hợp với nhân benzen của p-DMAB tạo nên phức chất dạng quinone cĩ màu đỏ.
Cơ sở sinh hĩa của thử nghiệm nhƣ sau: Tryptophan là một aminoacid cĩ thể bị oxy hĩa bởi một số vi sinh vật cĩ hệ enzyme tryptophanase t ạo ra sản phẩm chứa gốc indol.
Phƣơng pháp tiến hành: Vi sinh vật thử nghiệm đƣợc nuơi trong mơi trƣờng canh trypton trong kho ảng 24 - 48 giờ, sau đĩ nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac’s hoặc thuốc thử Erhlich, quan sát màu vài phút.
Đọc kết quả: Thử nghiệm (+) khi trên bề mặt mơi trƣờng xuất hiện vịng đỏ cánh sen. Thử nghiệm (-) khi trên bề mặt mơi trƣờng khơng xuất hiện vịng đỏ.
2.2.3 Thử nghiệm Metyl Red
Nguyên tắc: Nhằm xác định khả năng c ủa vi sinh vật sản xuất và duy trì các s ản phẩm acid bên trong mơi trƣờng trong quá trình lên men glucose. Cơ sở sinh hĩa :thử nghiệm Metyl red dựa trên cơ sở sử dụng chất chỉ thị pH là metyl red để nhận biết lƣợng ion H+ cĩ trong mơi trƣờng sau khi vi sinh vật lên men glucose. Hàm lƣợng hai chất này lại tùy thuộc vào con đƣờng chuyển hĩa của từng loại vi sinh vật. Đối với các vi sinh vật đƣờng ruột, thời gian nuơi c ấy từ 18 – 24 giờ, các vi sinh vật này đều
tạo acid trong mơi trƣờng khi chúng bắt đ ầu phát triển. Đối với các vi sinh vật cho phản ứng Metyl red âm tính thì ngay ban đầu một lƣợng acid hình thành trong mơi trƣờng nhƣng kéo dài thời gian nuơi cấy chuyển hĩa các sản phẩm acid này thành acetoin do đĩ làm pH mơi trƣờng trung tính.
Phƣơng pháp tiến hành: Nuơi cấy vi sinh vật trong mơi trƣờng MRPV, ủ trong khoảng 2 – 5 ngày, sau đĩ nhỏ vài giọt thuốc thử metyl red đƣợc pha theo tỷ lệ 0.1g trong 300ml cồn và cho vào nƣớc định mức 500ml.
Đọc kết quả : thử nghiệm (+) khi mơi trƣờng chuyển sang màu đỏ. Thử nghiệm (-) khi mơi trƣờng khơng đổi màu.
2.2.4 Thử nghiệm Voges-Proskauer
Nguyên tắc: Phát hiện khả năng vi sinh vật tạo thành một số sản phẩm trung tính acetoin trong quá trình lên men glucose.
Cơ sở sinh hĩa: Thử nghiệm này nhằm mục đích phát hiện acetoin, một sản phẩm trung tính trong quá trình trao đổi glucose trong tế bào vi sinh vật. Ở tế bào vi sinh vật, sự phân hủy glucose tạo ra sản phẩm trung gian là acid pyruvic, t ừ đĩ cĩ thể chia vi sinh vật thành 2 nhĩm theo con đƣờng chuyển hĩa pyruvic khác nhau : nhĩm trao đổi khơng tạo thành 2,3-butanediol nhƣ E.coli thử nghiệm (-) ; và nhĩm tạo 2,3- butanediol nhƣ Klebsiella thử nghiệm (+). Tuy nhiên thử nghiệm này nhằm xác định acetoin – tiền chất của 2,3-butanediol, vì là tiền chất nên quá trình nuơi cấy tích lũy rất ít, để dễ dàng phát hiện quá trình nuơi cấy thử nghiệm đƣợc tiến hành trong điều kiện hiếu khí, sau đĩ phát hiện acetoin trong mơi trƣờng bằng thuốc thử α- naphtol trong mơi trƣờng kiềm mạnh đƣợc tạo ra bằng KOH 40%.
Phƣơng pháp tiến hành: Nuơi cấy vi sinh vật trong mơi trƣờng MRPV ủ ở nhiệt độ 370C trong 2 – 5 ngày, sau đĩ nhỏ 2 giọt KOH 40% và 6 giọt α-naphtol rồi quan sát sự xuất hiện màu.
Đọc kết quả : thử nghiệm (+) khi xuất hiện màu đỏ trên bề mặt mơi trƣờng. Thử nghiệm (-) khi mơi trƣờng khơng đổi màu.
2.2.5 Thử nghiệm Citrate
Nguyên tắc: Nhằm xác định vi si sinh vật sử dụng citrate nhƣ nguồn carbon duy nhất
Cơ sở sinh hĩa: Năng lƣợng cung cấp cho vi sinh vật khi trong mơi trƣờng khơng cĩ nguồn nguyên liệu để sử dụng cho quá trình lên men hay tạo các sản phẩm lactic bằng cách sử dụng nguồn carbon duy nhất là citrate.
Bƣớc đầu tiên vi sinh vật tách citrate thành oxaloacetate và acetate, đây là hai s ản phẩm trung gian cho quá trình đồng hĩa citrate, cịn s ản phẩm nhận đƣợc của quá trình này phụ thuộc vào pH của mơi trƣờng. Nếu pH kiềm thì trong mơi trƣờng sẽ nhận đƣợc nhiều acetate và fomate, nếu pH acid thì sản phẩm tạo ra là lactatte, acetoin.
Nhƣ vậy sự biến dƣỡng citrate bởi vi sinh vật sẽ tạo ra CO2 làm kiềm hĩa mơi trƣờng. Mặt khác các vi sinh vật cĩ khả năng sử dụng citrate nhƣ là nguồn carbon duy