4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
1.2.2.Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài
Trong tổng kết về bệnh sán lá gan, Kendall (1954, 1965) [46] kết luận rằng F. gigantica phổ biến trên toàn thế giới và ký chủ trung gian của chúng là các loài ốc không dễ dàng phân biệt về mặt hình thái hoặc sinh thái. Tác giả cho rằng, các loài của vật chủ trung gian chắnh ở Nam, Tây và Đông châu Phi là L. natalensis, ở Ấn Độ, Bangladesh và Pakistan là L. rufescens. Một loài ốc tƣơng tự, L. ollula, là vật chủ trung gian của F. gigantica ở Nhật Bản (Ueno et al., 1975) và Hawaii (Alicata, 1938).
Trong nghiên cứu phòng thắ nghiệm, Boray (1985) [41] gây nhiễm thành công F. gigantica ở ốc L. stagnalis mới nở.
Một nghiên cứu hình thái tỷ mỉ và chắnh xác đã đƣợc thực hiện để phân biệt 2 loài F. hepatica và F. gigantica: (1) xem xét vùng phân bố địa lý của ốc Lymnae (2) chỉ sử dụng sán ở cùng một vật chủ; (3) Để tránh sai số kỹ thuật, sán đƣợc cố định, nhuộm và gắn tiêu bản bằng cùng một phƣơng pháp, trứng đƣợc xem tƣơi; (4) Sử dụng hệ thống phân tắch hình ảnh qua máy tắnh (CIAS) để có các số đo 2 chiều, 3 chiều và cung cấp các tỷ lệ có ý nghĩa cho các chỉ số. Nghiên cứu cho thấy, khi chỉ xem xét đặc điểm hình thái, mà không chú ý đến sự tƣơng quan giữa các số đo kắch thƣớc của sán trƣởng thành thì có thể không phân biệt đƣợc 2 loài. Từ kết quả phân tắch tƣơng quan, giá trị cực đại của đa số các cơ quan liên quan đến chiều dài cơ thể (BL) ở F. gigantica thƣờng lớn hơn rất nhiều so với F. hepatica. Ngƣợc lại, F. hepatica
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
có các số đo cực đại liên quan đến chiều rộng cơ thể (BW). Những giá trị cực đại này cho thấy, đặc điểm đặc trƣng của F. gigantica là phát triển theo chiều dài hơn so với F. hepatica. Mặc dù kắch thƣớc từ mút trƣớc cơ thể đến giác bụng dƣờng nhƣ không khác nhau nhiều giữa 2 loài, song nghiên cứu tƣơng quan cho thấy đặc điểm hình thái khác nhau cho phép phân biệt 2 loài F.
hepatica và F. gigantica ở trong cùng một vật chủ. Nghiên cứu về tỷ lệ phát
triển cho thấy, chỉ có tỷ lệ chiều dài/chiều rộng (BL/BW) là giá trị chắnh xác để phân biệt 2 loài.
Một câu hỏi đặt ra là, liệu có 2 loài F. hepatica và F. gigantica không?. Đa số các nhà phân loại học mô tả dựa trên quan niệm về loài theo Linnaeus và duy trì cho đến ngày nay. Thậm chắ, việc sử dụng các phƣơng pháp và kỹ thuật mới có giá trị phân loại Fasciola (Mas-Coma et al., 2005) [48].
Nhƣ vậy, phân loại sán lá Fasciola chủ yếu dựa trên hình thái sán trƣởng thành, kắch thƣớc trứng, vật chủ chắnh, vật chủ trung gian và phân bố địa lý. Về hình thái sán trƣởng thành, các chỉ số tƣơng quan và sự khác biệt về tỷ lệ chiều dài/chiều rộng (BL/BW) có thể giúp phân biệt 2 loài F. hepatica và F. gigantica.
Về vật chủ chắnh, F. hepatica và F. gigantica có chung nhiều loài vật chủ ăn cỏ và ăn tạp (Mas-Coma, 1995) [47]. Tắnh mẫn cảm và đặc điểm bệnh lý do sán lá gan gây ra khác nhau đáng kể ở các vật chủ khác nhau. Nghiên cứu về Enzyme cho thấy, F. hepatica và F. gigantica khác nhau. Sự khác biệt giữa 2 loài chỉ có 5 vị khác khác nhau ở ITS-1 và 5 vị trắ khác nhau ở ITS-2. (Mas-Coma và Bargues, 2005) [48]. Có nhiều bằng chứng cho thấy, F.
hepatica có liên quan với nhóm Galba nguồn gốc từ Bắc cực, Trung và Nam
Mỹ với G. truncatula là vật chủ trung gian. Ngƣợc lại, F. gigantica dƣờng nhƣ liên quan đến nhóm ốc Radix, chủ yếu là loài R. natalensis ở châu Phi và loài R. auricularia ở Palaearctic. Sự chuyên biệt về ốc vật chủ trung gian này giải thắch sự phân bố địa lý của 2 loài sán lá gan. Trái lại, F. hepatica có thể lan rộng từ châu Âu đến tất cả 5 lục địa, F. gigantica chỉ giới hạn ở châu Phi
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
và châu Á (kể cả Hawaii). Yêu cầu sinh thái của ốc cũng giải thắch tại sao F.
hepatica lại phổ biến ở vùng ôn đới và nhƣ vậy phổ biến ở châu Âu, châu Mỹ
và châu Đại dƣơng, trong khi F. gigantica thắch nghi ở vùng nhiệt đới và ẩm ở châu Phi và châu Á.
Tóm lại, những bằng chứng trên cho thấy tắnh đặc hiệu của 2 loài F. hepatica và F. gigantica, chúng là 2 loài khác nhau. Tuy nhiên, có thể có sự lai giữa 2 loài ở châu Phi và châu Á, một quy luật chung khi có sự tiếp xúc giữa 2 loài ở trong cùng một vật chủ. Chúng duy trì khả năng lai chéo vì với thời gian vài nghìn năm từ khi tách biệt từ tổ tiên chung thì chƣa đủ để có bộ gen hoàn toàn khác biệt.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Chƣơng 2
NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng, thời gian, địa điểm nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Bệnh sán lá gan (Fasciolosis) ở trâu, bò. - Trứng và ấu trùng sán lá gan Fasciola spp.
2.1.2. Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 2 năm 2012 đến tháng 2 năm 2013.
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu
- Đề tài đƣợc thực hiện ở các nông hộ và các trại chăn nuôi trâu, bò gia đình tại ba huyện, thành của tỉnh Tuyên Quang: Huyện Hàm Yên, huyện Yên Sơn và thành phố Tuyên Quang.
- Địa điểm xét nghiệm mẫu:
+ Bộ môn Bệnh Động vật và phòng Chẩn đoán bệnh Ờ Khoa Chăn nuôi thú y Ờ Trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
+ Phòng ký sinh trùng Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật Hà Nội
2.2. Vật liệu nghiên cứu
2.2.1. Mẫu nghiên cứu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Mẫu phân trâu, bò, mẫu đất (cặn) nền chuồng, mẫu đất ở xung quanh chuồng trâu, bò.
- Mẫu đất bề mặt, mẫu nƣớc chỗ trũng trên bãi chăn thả trâu, bò, mẫu cỏ thuỷ sinh.
- Mẫu ốc thu thập từ các ao, ruộng, suối trong khu vực chăn thả trâu, bò. - Trứng sán lá Fasciola spp. phân lập từ phân của trâu, bò bệnh (để bố trắ các thắ nghiệm).
2.2.2. Dụng cụ và hoá chất
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ - Buồng đếm trứng giun sán Mc.Master.
- Dụng cụ xét nghiệm mẫu: Cốc thuỷ tinh, đĩa Petri, lam kắnh, la men, lƣới lọc phân và các dụng cụ thắ nghiệm khác.
- Các bình thủy tinh kắch thƣớc 60 x 30 x 30 cm để nuôi ốc thắ nghiệm. - Các chậu thủy tinh, khay nhựa, khay men để bố trắ các thắ nghiệm theo dõi thời gian sống của trứng sán lá gan trong phân trâu, bò và trong môi trƣờng đất.
- Thuốc Han-Dertil B, Bio-Alben.
2.3. Nội dung nghiên cứu
2.3.1. Thực trạng công tác vệ sinh thú y và phòng chống bệnh ký sinh trùng cho trâu, bò tại tỉnh Tuyên Quang. cho trâu, bò tại tỉnh Tuyên Quang.
2.3.2. Đặc điểm dịch tễ bệnh sán lá gan lớn ở trâu, bò
2.3.2.1. Tình hình nhiễm sán lá gan ở trâu và bò
- Tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm sán lá gan theo địa phƣơng - Tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm sán lá gan theo tuổi trâu, bò - Tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm sán lá gan theo mùa vụ
- Tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm sán lá gan theo tắnh biệt trâu, bò
2.3.2.2. Nghiên cứu sự ô nhiễm trứng và ấu trùng sán lá gan ở ngoại cảnh và trong ký chủ trung gian trong ký chủ trung gian
- Sự ô nhiễm trứng sán lá gan ở chuồng trại, bãi chăn thả
- Xác định loài ốc nƣớc ngọt Ờ ký chủ trung gian của sán lá gan
Fasciola spp và sự phân bố của chúng ở tỉnh Tuyên Quang.
- Tỷ lệ nhiễm ấu trùng sán lá gan ở ốc nƣớc ngọt - Tỷ lệ mẫu cỏ thủy sinh nhiễm Adolescaria
2.3.2.3. Nghiên cứu về thời gian sống của trứng sán lá gan ở ngoại cảnh (khi chưa rơi vào môi trường nước) chưa rơi vào môi trường nước)
- Thời gian sống của trứng sán lá gan trong phân trâu, bò - Thời gian sống của trứng sán lá gan trong đất
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
2.3.2.4. Nghiên cứu thời gian Miracidium thoát vỏ và thời gian tồn tại của Miracidium trong nước Miracidium trong nước
- Thời gian Miracidium thoát vỏ từ khi trứng rơi vào môi trƣờng nƣớc - Thời gian Miracidium tồn tại trong nƣớc (khi không gặp ký chủ trung gian).
2.3.2.5. Nghiên cứu thời gian phát triển của ấu trùng sán lá gan trong ốc Ờ ký chủ trung gian chủ trung gian
- Thời gian hoàn thành các giai đoạn ấu trùng của sán lá gan trong ốc - ký chủ trung gian.
- Thời gian từ khi trứng sán lá gan rơi vào môi trƣờng nƣớc đến khi hình thành Adolescaria.
2.3.3. Đề xuất biện pháp phòng chống bệnh sán lá gan cho trâu, bò ở tỉnh Tuyên Quang Tuyên Quang
- Xác định hiệu lực tẩy sán lá gan trâu, bò của 2 loại thuốc: Han-Dertil B và Bio - Alben.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.4.1. Phương pháp điều tra tình hình vệ sinh thú y và phòng chống bệnh sán lá gan cho trâu, bò ở tỉnh Tuyên Quang sán lá gan cho trâu, bò ở tỉnh Tuyên Quang
- Trực tiếp quan sát
- Kết hợp phỏng vấn và phát phiếu điều tra
2.4.2. Phương pháp nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ bệnh sán lá gan trâu, bò ở tỉnh Tuyên Quang trâu, bò ở tỉnh Tuyên Quang
2.4.2.1. Nghiên cứu dịch tễ học bệnh sán lá gan ở trâu, bò: Sử dụng phƣơng
pháp dịch tễ học phân tắch và dịch tễ học mô tả.
2.4.2.2. Quy định những yếu tố cần xác định liên quan đến tình hình nhiễm sán lá gan trâu, bò sán lá gan trâu, bò
- Tuổi trâu, bò: Trâu, bò đƣợc phân ra 4 lứa tuổi: + Dƣới 2 năm tuổi
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ + 5 năm Ờ 8 năm tuổi
+ Trên 8 năm tuổi
- Mùa vụ: mùa vụ trong năm đƣợc theo dõi gồm 4 mùa: + Mùa Xuân : từ tháng 2 - tháng 4; + Mùa Hè : từ tháng 5 - tháng 7; + Mùa Thu : từ tháng 8 - tháng 10;
+ Mùa Đông : từ tháng 11 - tháng 1 năm sau.
2.4.2.3. Sơ đồ bố trắ thu thập mẫu
- Bố trắ thu thập mẫu tại 3 huyện, thị xã của tỉnh Tuyên Quang theo phƣơng pháp lấy mẫu ngẫu nhiên, phân tầng.
Bảng 2.1: Sơ đồ bố trắ thu thập mẫu
Loại mẫu Số mẫu/huyện, thành Số huyện, thị xã Số xã/huyện Mẫu phân 2449 3 4 Mẫu nền chuồng 932 3 4
Mẫu đất bề mặt, xung quanh chuồng 932 3 4
Mẫu đất bề mặt băi chăn 476 3 4
Mẫu nƣớc đọng ở bãi chăn 414 3 4
Mẫu ốc nƣớc ngọt 3156 3 4
Mẫu đƣợc thu thập ngẫu nhiên tại các nông hộ, trang trại chăn nuôi trâu, bò tại tỉnh Tuyên Quang.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Các loại mẫu đƣợc xét nghiệm ngay trong ngày hoặc xét nghiệm sau khi bảo quản theo quy trình bảo quản mẫu trong nghiên cứu ký sinh trùng học.
2.4.2.4. Phương pháp xác định tỷ lệ và cường độ nhiễm sán lá gan trâu, bò qua xét nghiệm phân. qua xét nghiệm phân.
* Phƣơng pháp thu thập mẫu phân
Thu nhập mẫu phân ngẫu nhiên ở trâu, bò nuôi ở các nông hộ, trại tập thể và gia đình. Lấy phân trực tiếp từ trực tràng con vật. Để riêng mỗi mẫu vào một túi nilon nhỏ, mỗi túi đều có nhãn ghi: loại gia súc (trâu, bò), địa điểm, tuổi, trạng thái phân, thời gian lấy mẫu và các biểu hiện lâm sàng của trâu, bò (nếu có). Ngoài ra, căn cứ vào những yếu tố cần xác định có liên quan đến đặc điểm dịch tễ để lấy mẫu cho tƣơng đối đồng đều về các yếu tố khác.
* Phƣơng pháp xác định tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm sán lá gan
Xét nghiệm mẫu bằng phƣơng pháp lắng cặn Benedek (1943) : Cho từng mẫu phân vào cốc thủy tinh, thêm 5 Ờ 10 lần nƣớc, khuấy tan, lọc qua lƣới lọc bỏ cặn bã thô. Nƣớc lọc đƣợc để yên 15 Ờ 20 phút cho lắng xuống, gạn nƣớc trên đi, lại cho nƣớc vào, làm đi làm lại nhiều lần cho đến khi nƣớc trong suốt, gạn nƣớc đi, cho cặn lên phiến kắnh, soi kắnh hiển vi để tìm trứng sán lá gan. Những mẫu phân tìm thấy trứng sán lá gan đƣợc xác định là có nhiễm, ngƣợc lại là không nhiễm.
- Phƣơng pháp đánh giá cƣờng độ nhiễm sán lá gan
Xác định cƣờng độ nhiễm sán lá gan bằng phƣơng pháp đếm trứng Mc. Master (đếm số trứng/gam phân trên buồng đếm Mc.Master theo tài liệu của Jorgen Hansen và cs, 1994) [44]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.4.3. Phương pháp nghiên cứu trứng và ấu trùng sán lá gan ở ngoại cảnh và trong ký chủ trung gian và trong ký chủ trung gian
2.4.3.1. Phương pháp nghiên cứu sự ô nhiễm trứng sán lá gan ở nền chuồng
và khu vực xung quanh chuồng nuôi trâu, bò.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
+ Mẫu đất hoặc cặn nền chuồng trâu, bò: Tại mỗi ô chuồng, lấy mẫu đất (cặn) ở 4 góc chuồng và ở giữa chuồng, trộn đều đƣợc một mẫu xét nghiệm (khoảng 80 Ờ 100 g/mẫu). Mỗi mẫu đƣợc để riêng trong túi nilon có nhãn ghi địa điểm và thời gian lấy mẫu.
+ Mẫu đất bề mặt xung quanh chuồng nuôi: Lấy mẫu đất bề mặt tƣơng tự nhƣ cách lấy mẫu cặn nền chuồng.
- Phƣơng pháp xét nghiệm mẫu
Xét nghiệm bằng phƣơng pháp lắng cặn Benedek để phát hiện trứng sán lá gan.
2.4.3.2. Phương pháp nghiên cứu sự ô nhiễm trứng sán lá gan trên đất ở khu vực bãi chăn thả.
- Phƣơng pháp thu thập mẫu đất bề mặt ở khu vực bãi chăn thả trâu, bò. Mẫu đất bề mặt ở khu vực bãi chăn thả trâu, bò: Tại mỗi khu vực chăn thả, cứ khoảng 20 Ờ 30 m2 lấy ngẫu nhiên ở vị trắ 4 góc và ở giữa, trộn đều đƣợc một mẫu xét nghiệm, khối lƣợng khoảng 80 Ờ 100 g/mẫu. Mỗi mẫu đƣợc để riêng trong túi nilon có nhãn ghi địa điểm và thời gian lấy mẫu.
- Xét nghiệm mẫu bằng phƣơng pháp lắng cặn Benedek.
2.4.3.3. Phương pháp xác định tỷ lệ mẫu cỏ thủy sinh nhiễm Adolescaria
- Phƣơng pháp lấy mẫu
Lấy mẫu cỏ thủy sinh ở rìa bờ ao, kênh, mƣơng, rãnh nƣớc gần chuồng hoặc trên bãi chăn thả trâu, bò. Lấy ở các vị trắ khác nhau, mỗi mẫu lấy khoảng 30 - 40 cây cỏ. Đựng mẫu trong túi nilon sạch có nhãn ghi thời gian và địa điểm lấy mẫu.
- Phƣơng pháp xét nghiệm
Dùng Adolescaria trong các mẫu cỏ thủy sinh bằng các phƣơng pháp sau: + Dùng kắnh lúp soi kĩ từng cây cỏ trong một mẫu để tìm kén Adolescaria
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
phóng đại 4 x 10 lần, phân biệt Adolescaria của sán Fasiola với kén của các loài sán khác, từ đó xác định sự phát tán ấu trùng sán lá Fasciola ở cỏ thủy sinh.
+ Rửa mẫu cỏ thủy sinh trong cốc thủy tinh dung tắch 500ml có chứa nƣớc sạch, rửa kỹ từng cây cỏ, sau đó vớt cây cỏ ra, để yên 20 Ờ 30 phút cho
Adolescaria lắng xuống, rồi gạn phần nƣớc ở trên đi, giữ lại cặn. Dùng công
tơ gút hút cặn nhỏ lên phiến kắnh, đậy lamen và soi dƣới kắnh hiển vi độ phóng đại 100 lần để tìm Adolescaria.
+ Dùng dao nhỏ nhẹ nhàng nạo lấy lớp ngoài của cỏ thủy sinh, cho vào cốc thủy tinh có nƣớc, khuấy kỹ rồi để yên 20 - 30 phút cho cặn láng xuống, gạn từ từ nƣớc ở trên đi, dùng công tơ gút hút cặn nhỏ lên phiến kắnh, đậy lamen và soi dƣới kắnh hiển vi độ phóng đại 100 lần để tìm Adolescaria.
2.4.3.4. Phương pháp xác định tỷ lệ mẫu nước ở khu vực chăn thả trâu, bò nhiễm trứng sán lá gan
* Phƣơng pháp thu thập mẫu
Dùng que khuấy đều các vũng nƣớc trên bãi chăn thả, lấy cốc thủy tinh múc